 |
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ
Общие положения. Т -(тимусзависимые) и В-(бурсазависимые) лимфоциты имеют определенные морфофункциональные различия, по которым разработан рад методов позволяющих выделить и идентифицировать эти клетки.
Наиболее широко применяют методы выделения лимфоцитов из перефирической крови и органов, основанные на принципе различной скорости седиментации их в градиентах плотности. Последние изготавливают из различных веществ с высокой молекулярной массой—таких как сахароза, гуммиарабик, сывороточным альбумин (БСА), синтетические соединения (фикол, перкод, верографин, урографин, метризоат и др.), а также их смесей, комбинируя которые готовят растворы с плотностью 1,050—1,090 (в этих пределах можно разделить практически клетки всех тканей).
Однако для выделения клеток крови новорожденных животных (телят, егнят) пригодны далеко не все рекомендуемые градиенты плотности. Эта особенность связана с повышенной чувствительностью клеточных мембран новорожденных к изменению осмотического давления, ионного состава и pH среды.
Поэтому при изготовлении градиентов плотности для разделения клеток новорожденных необходимо контролировать не только плотность раствора (1,068— 1,071), но также осмоляльность-295-305 миллиосмолей (мосмоль) и pН (7,38—7,41).
Осмотическое давление растворов измеряют специальным прибором — осмометром или рассчитывают приближенно по формуле: Р = C/M, где Р — осмотическое давление в миллиосмолях; С — концентрация веществ в мг/л; М — молекулярная масса вещества. Как видно из формулы, наибольшее влияние на величину осмотического давления оказывают вещества с малой молекулярной массой, легко диссоциирующие соли минеральных кислот — соляной, серной и т. д. Оптимальными условиями сохранения жизнеспособности клеток при их выделении, отмывании и других процедурах являются наличие ионов К. Na, Са, Mg, Cl и др. в соотношениях, близких к плазме крови, а также присутствие белков. С этой целью при изготовлении градиентов плотности отмывающих и разбавляющих сред используют сложные солевые составы, содержащие небольшие количества либо аутологичных сывороточных белков, либо инактивированную эмбриональную сыворотку плодов крупного рогатого скота — ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка).
Жизнеспособность лимфоцитов крови обеспечивается постоянно протекающими процессами обмена в клетках и сопровождается определенными энергетическими затратами, которые в основном обеспечиваются гликолизом. При дефиците глюкозы в растворах или при длительном (в течение нескольких часов) пребывании клеток крови в среде с температурой выше 4°С процессы гликолиза могут нарушаться за счет исчерпывания ресурсов и приводить к гибели клеток.
Для обратимого ингибирования гликолиза в некоторых случаях применяют азид натрия (NaN3, х.ч.), например при передержке клеток в среде без глюкозы, для стабилизации розеток, легко распадающихся вследствие высокой скорости обменных процессов в мембранах. Действие азида натрия в конечной концентрации (0,05%-ная) обратимо, функция Т- и В-лимфоцитов полностью восстанавливаются после трехкратного отмывания. При внесении в градиент большого количества клеток возможно их слипание при центрифугировании, особенно если его проводят в одном режиме, а не дифференциально. Клетки крови телят склонны к самоагрегации, чему способствует несоответствие pH и изотоничности растворов. Контроль оптимальности условий выделения лимфоцитов осуществляют путем учета количества выделенных лимфоцитов в сравнении с фактическим содержанием их в 1 мл крови (то есть процент выделения), процент их жизнеспособности (определяется по поглощению коллоидных красителей погибшими клетками), чистоты популяции лимфоцитов (то есть процент примеси клеток других групп — нейтрофилов, эритроцитов и др.).
Лимфоциты сохраняют функциональную способность к иммунным реакциям в течение первых 4—6 ч после взятия крови; это время зависит от характера взятия (стерильное, загрязнено микроорганизмами), стабилизатора крови (например, гепарин вызывает ускоренное «старение» клеток), условий хранения, состояния организма донора и др. Поэтому исследования иммунокомпетентных клеток крови, основанные на тестах розеткообразовання лимфоцитов с эритроцитами или корпускулярными нагруженными индикаторами (зимозан, латекс и др.), нужно проводить в течение первых часов после взятия крови, так как к реакциям данного типа способны только живые клетки. Срок хранения крови увеличивается при стерильном ее взятии, добавлении в стабилизатор ингибиторов метаболизма (при этом процесс ингибирования должен быть обратимым), при содержании ее в температурных условиях, близких к 0°С.
Идентификация Т- и В-лимфоцитов по их функциональным особенностям часто основана на способности Т-лимфоцитов образовывать розетки с гетерологичными эритроцитами, например эритроцитами барана (так называемые Е-розетки). Поверхностные мембранные рецепторы B-лимфоцитов имеют иммунное сродство к комплементу и образуют иммунную связь с Сз-компонентами комплексов ЕАС. Комплекс антитело — комплемент (АС) может быть связан с поверхностными рецепторами эритроцитов (ЕAC-комплекс) или комплемент сорбируются на поверхности корпускулярной частицы, например зимозана (ЗС3-комплекс). Для установления иммунных связей между рецепторами лимфоцитов и гетерологичных эритроцитов или иммунных комплектов необходимы определенные условия. Процесс образования связей включает сближение лимфоцитов с индикаторами (эритроциты, частицы зимозана и др.), контакт, установление связи ее консолидацию (уплотнение), а при учете реакции в фиксированных препаратах на предметных стеклах необходима фиксация связи за счет поперечны сшивок в молекулах белка.
Сближение лимфоцитов с индикаторами достигается внесением достаточного количества корпускулярных частиц индикатора (30—40 эритроцитов на 1 лимфоцит), мягким центрифугированием (250—300 g) с целью осаждения всех частиц и лимфоцитов. Образование иммунных связей происходит наиболее интенсивно при температуре, близкой к температуре тела исследуемого животного для чего пробы инкубируют около 30 мин при 37°С. Образование Е-розеток Т-лимфоцитами непрочное и подвержено самораспаду из-за высокой метаболической активности поверхностных мембран. Для сохранения их используют либо АЗИД НАТРИЯ (0,05%-ной конечной концентрации), либо охлаждение проб. Охлаждение около 00С способствует консолидации связей, а для их фиксации применяют раствор глутарового альдегида в конечной концентрации не выше 0,05%(более высокие концентрации его способны к сшивкам неспецифических.
СОСТАВ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИГОТОВЛЕНИЕ НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ПРИМЕНЯЕМЫХ РАСТВОРОВ ПРИ ВЫДЕЛЕНИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.
1. FICOLL — Paque — импортный препарат (Швеция). Препарат продается расфасованным ю
по флаконам (100 мл) в готовом виде.
2. Percoll — полимер на основе кремния, импортный препарат. Предназначен приготовления градиентов плотности, применяемых при центрифугировании Стерильный препарат поставляют в пластиковых флаконах (1000 мл) с плотностью 1,131. Готовят требуемые градиенты на физрастворе, так как сам препарат не сбалансирован по изотоничности. При использовании несбалансированных растворов (или дистиллированной воды) происходит гемолиз эритроцитов. Плотность контролируют ареометром или же для приготовления градиента используют специальные устройства.
|
3. FICOLL 400 -синтетический полисахарид. Белый порошок с молекулярной массой 400 000. Применяют для приготовления градиентов плотности в составе с другими солеными растворами, часто с рентгеноконтрастными веществами - урографином, верографином.
Приготовление раствора фикол-верографина с плотностью 1,071 для выделения лимфоцитов: 9,5 фикола 400 растворяют в 100 мл подогретого до 60-70С забуференного фосфатами до pH 7,41 физиологического раствора хлорида натрия (ЗФР) (приготовление см. ниже) и добавляют 20 мл 60%-ного раствора верографина (Verografin). Плотность корректируют добавлением либо несколько капель верографина (для повышения ее), либо забуференного физраствора (для понижения) под контролем ареометра. Для приготовления растворов их нужно стерилизовать (например, пропускать через стерилизующие фильтры) и хранить стерильно закрытыми при температуре не выше 8°С.
Забуференный фосфатами физиологический раствор хлорида натрия (ЗФР)рН 7,41 готовят следующим образом: 11,9 г двузамещенного кислого фосфорнокислого натрия (Na2HPO4*2H20, х.ч.) растворяют в 1 л 0,15 моль/л раствора хлорида натрия (NaCI, х.ч.). 9,1 г однозамещенного фосфорнокислого калия KH2PO4, х. ч. ) растворяют в 1 л. 0,15 моль/л раствора хлорида натрия. Для получения раствора, требуемого pH 82,5 мл раствора Na2HPО4 доводят до 100 мл раствором КН2РО4 под контролем рН-метра.
4. Раствор Хенкса применяют для отмывания клеток, ресуспендирования их и т. д. В 1 л дистиллированной воды растворяют 8 г хлорида натрия, 0,4 г хлорида калия (КСI, х.ч.), 0,047 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HP04*2H20), 0,35 г бикарбоната натрия (NaHCO3, х.ч.), 0,6 г однозамещённого фосфорнокислого калия (КН2Р04), 1 г глюкозы, 0,017 г фенилового красного. pH доводят до 7,2 с помощью концентрированного раствора едкого натра (NaOH).
5. Раствор Олсвера применяют для отмывания, ресуспендирования и хранения эритроцитов и др. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2,05 г декстрозы, 0,8 г натрия лимоннокислого, 0,42 натрия хлорида. Раствор доводят до pH 6,1 10%-ным раствором лимонной кислоты (х.ч.) под контролем pH-метра.
6. Суспензией эритроцитов барана (ЭБ) выявляют поверхностные мембранные рецепторы Т-лимфоцитов в тесте прямого или спонтанного розеткообразовання.
Приготовление рабочей суспензии ЭБ. Стерильно взятую в шприц кровь барана со стабилизатором разливают в центрифужные пробирки. Центрифугируют при 1000—1200 g 15 мин и трижды отмывают ЗФР. После третьего отмывания из осадка ЭБ (который принимают за 100%-ную концентрацию) готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ в растворе Олсвера. При добавлении антибиотиков (пенициллин+стрептомицин) ЭБ сохраняются 2—3 нед. Для постановки реакции розеткообразования лучше брать ЭБ, приготовленные за 1— 2 сут. Перед использованием ЭБ вновь отмывают ЗФР при 1000 g дважды, после чего готовят рабочее разведение.
7. Суспензия зимозана (3). Применяют для выявления C3-рецепторов на поверхности В-лимфоцитов в качестве носителя комплемента. Выпускают в виде ампулированной стерильной суспензии (хранят при 4-20°С) или во флаконах по 4 г в виде сухого порошка (срок хранения при 4-10°С 2 года).
Список часто употребляемых сокращений.
В-лимфоциты — бурсазависимыс лимфоциты.
Т-лимфоциты — тимусзависимые лимфоциты.
С — комплемент.
С3 — третий компонент комплемента.
3-зимозан.
ЗСз-комплекс-зимозан, на поверхности которого сорбирован третий компонент комплемента.
ЭБ — эритроциты барана.
ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка.
ЗФР — забуференный фосфатами физиологический раствор хлорида натрия.
РОК-розеткообразующие клетки, имеющие на поверхностной мембране рецепторы, комплементарные поверхностным антигенным рецепторам гетерологичных эритроцитов, либо третьему компоненту комплемента (С3), либо Fc-фраг-менту иммунных белков.
Е-РОК — клетки, образующие розетки с гетерологичными эритроцитами
ЕАС-комплекс — комплекс «комплемент +антиген», сорбированный на поверхности эритроцита.
ЕАС-РОК — клетки, образующие розетки с эритроцитами, нагруженными «антиген + комплемент» комплексом.
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ИЗ КРОВИ НА ГРАДИЕНТАХ ПЛОТНОСТИ МЕТОДОМ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ.
Принцип.
При центрифугировании разбавленной крови на градиенте плотности клетки крови из-за их различной плотности под действием центробежного ускорения движутся с различной скоростью, при этом происходит их разделение: эритроциты оседают на дно пробирки, гранулоциты находятся над эритроцитами, а лимфоциты, как менее плотные клетки, остаются на границе раздела: разбавленная кровь — жидкость с большой плотностью (фиколл-верографин, перколл и др.).
Реактивы.
1. Раствор фикол-верографина с плотностью 1,071 при 4°С, pH 7,38-7,41, осмоляльность 295-305 мосм.
2. ЗФР pH 7,41.
3. Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС). Добавляется в ЗФР в количестве 2% при отмывании клеток.
4. 0,5%-ный раствор трипанового синего на ЗФР.
5. Азид натрия (NaN3, х. ч.).
Оборудование.
1. Центрифуга с охлаждением
2. Микроскоп световой биологический;
3. Камера Горяева;
4. Пробирки стеклянные 100х10мм
5. Шприцы на 2, 5, 10 мл;
6. Иглы инъекционные;
7. Пипетки пастеровские;
8. Ареометр для определения плотности растворов от 1,060 до 1,120 (ГОСТ 1300-57 № 5).
Ход выделения.
1 мл крови, стерильно вносят стабилизатор (см. стр. 213), разбавляют ЗФР 1 : 1 и 2 мл из шприца через тонкую иглу наносят на поверхность фикол-верографин, налитого в пробирки 100х10 мм Высота столбика градиента должна быть не менее 50 мм), выдерживают 15—20 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 4°С дифференциально по схеме: 15 мин -450-500 g, 10 мин -800-900 g, 15 мин-950-1000g.
После центрифугирования в пробирке происходит разделение клеток (рис. 12). Эритроциты оседают на дно, в средних и нижних слоях фнкол-верографин находятся гранулоциты, а на границе их и разбавленной плазмы в виде, беловатого колечка находятся лимфоциты. Тонкой инъекционной иглой с заточенным концом 1 мл шприцем с подпружиненным поршнем осторожно отсасывают лимфоциты с некоторым количеством фикол-верографина и переносят чистую пробирку. Ресуспендируют в ЗФР с добавлением 2% ЭТС (несколько раз набирают шприц и выпускают суспензию клеток) и трижды отмывают, каждый раз центрифугируя при 900-1000 g -10—15 мин, удаляя супернатант и осторожно ресуспендируя клетки в свежих порциях ЗФР + ЭТС. После третьего отмывания клетки ресуспендируют 0,5 мл ЗФР-ЭТС; проводят определение
концентрации, жизнеспособности и чистоты выделенных лимфоцитов.
|
Концентрацию клеток при массовых исследованиях можно определять на целоскопе или камерным методом — в счетной камере Горяева. Жизнеспособность клеток устанавливают путем подсчета процента окрашенных клеток после добавления к капле взвеси клеток, наслоенной тонко оттянутой пастеровской пипеткой на предметное стекло, и добавления раствора 0,5% ного раствора трипанового голубого. Капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом через 5-7 мин.
Процент примеси к лимфоцитам определяют на фиксированном и окрашенном любыми методами тонком мазке взвеси клеток. Для дальнейших работ по верификации Т- и В-лимфоцитов готовят рабочую взвесь лимфоцитов с концентрацией клеток 3—4*10/6 в 1 мл, либо разбавляя суспензию ЗФР, либо концентрируя ее центрифугированием. Процент жизнеспособных клеток должен быть не менее 98, чистота выделенных фракций лимфоцитов — не менее 95%.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ОБРАЗОВАНИЯ РОЗЕТОК С ЭРИТРОЦИТАМИ БАРАНА (Е-РОК)
Принцип.
Т-лимфоциты имеют рецепторы на поверхности мембраны, способные оброзовывать иммунную связь с поверхностными антигенами гетерологичных эритроцитов (например, ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА). При этом эритроциты, располагаясь по окружности лимфоцита, образуют фигуру наподобие розетки (цв. табл. VII—VIII).
Реактивы.
1. 0,5%-ная суспензия ЭБ.
2. ЗФР (pH 7,41).
3. Раствор Олевера (рН 6,1)
4. Метанол (яд!).
5. 0,6% -ный раствор глутарового альдегида.
6. Краситель «Азур II».
7. Краситель «Эозин БА».
8. Краситель «Прочный зеленый» (Fast. Green, FCF, «Sigma»).
9. Краситель «Светлый зеленый» (Light Green, SF, «Serva»).
10. ЭТС.
11. Рабочая взвесь лимфоцитов 3—4 млн. клеток/мл в ЗФР с добавлением 2,5% ЭТС.
Оборудование.
Центрифуга с охлаждением; термостат; холодильник на 4°С; микроскоп световой (МБР-3); пипетки на 1, 5, 10 мл; пипетки пастеровские; предметные стекла обезжиренные.
Ход определения. К 0,25 мл рабочей взвеси лимфоцитов добавляют 0,25 мл 0,5%-ной суспензии ЭБ. Выдерживают при комнатной температуре 20—25 мин, центрифугируют при 300—400 g 5 мин, инкубируют при 4°С 15—18 ч.
Образовавшиеся иммунные связи фиксируют 0,6%-ным раствором глутарового альдегида на ЗФР pH 7,41, добавляя 0,3 мл по каплям и осторожно ресуспендируя клетки через 15—20 мин инкубации. Суспензию трижды отмывают дистиллированной водой, центрифугируют по 5 мин при 250—300 g, каждый раз ресуспендируют, набирая взвесь клеток через тонкую иглу 1 мл шприцем с подпружиненным поршнем. На предметное стекло наносят каплю взвеси клеток в трех местах, при этом каждая капля должна занимать площадь около 1 см в диаметре. Стекло кладут горизонтально и высушивают феном. Затем препарат фиксируют метиловым спиртом и окрашивают обычными гематологическими красками; используют также ускоренный метод, применяя раздельно основной и кислый красители — при этом значительно сокращается время окраски (до 1 —1,5 мин) и уменьшается потеря клеток при длительных проводках в водных растворах красок.
1. Двухкомпонентная окраска с цветовой дифференциацией типов клеток: эритроциты — розово-красные, лимфоциты — темно-синие, до фиолетового цвета ядро и голубая цитоплазма. Красители: а) 1%-ный раствор «Эозина БА» в 76%-ном этиловом спирте с добавлением 0,5% глицерина (х.ч.). Краску наносят на фиксированный препарат на 10—15 с, после чего смывают дистиллированной водой; б) 0,3%-ный водный раствор «Азур II» pH 7 наносят на препарат после красителя «а» на 30—40 с и смывают дистиллированной водой.
2. Двухкомпонентная окраска с цветовой дифференциацией типов клеток: эритроциты — изумрудно-зеленые, лимфоциты, цитоплазма и ядерные катионные белки — светло-зеленые и изумрудные, ядерные хроматиновые структуры — темно-синие. Красители: а) забуференный до pH 8,6 1 %-ный водный раствор красителя «Прочного зеленого»; б) 0,3%-ный водный раствор «Азур II» pH 7. Краситель «а» наносят на фиксированный препарат на 1 —1,5 мин, смывают забуференным до pH 8,6 физиологическим раствором хлористого натрия, после чего докрашивают 30 с «Азуром II» и смывают нейтральной дистиллированной водой. Вместо красителя «Прочного зеленого» используют 1%-ный раствор «Светлого зеленого».
Учет розеткообразующих клеток проводят под иммерсией микроскопа. Учитывают все клетки, присоединившие три эритроцита н более.
Определяют их процент к общему числу лимфоцитов и содержание абсолютного числа в 1 мкл крови.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ В-ЛИМФОЦИТОВ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ РЕЦЕПТОРОВ К ТРЕТЬЕМУ КОМПОНЕНТУ КОМПЛЕМЕНТА.
Принцип.
Установлено, что на В-лимфоцитах имеется рецептор для третьего компонента комплемента. Определение комплемент-рецептора является одним из тестов при определении В-лимфоцитов, для чего соединяют лимфоциты с эритроцитами барана, нагруженными комплементом (ЕАС-комплекс).
Реактивы:
1. Раствор Хенкса.
2. ЗФР pH 7,41+2% ЭТС.
3. Сухая гемолитическая сыворотка против ЭБ (гемолизин).
Ход определения.
ЭБ трижды отмывают раствором Хенкса и готовят 5%>-ную взвесь в этом растворе. Сухую гемолитическую сыворотку разводят раствором Хенкса до титра 1 : 500. Смешивают в объемах (1 : 1) 5%-ную взвесь ЭБ и гемолитическую сыворотку. Инкубируют при 37°С 30 мин и отмывают раствором Хенкса, центрифугируя при 800 g 5 мин. Отмытые ЭБ инкубируют с равным объемом комплемента (в качестве источника которого можно использовать сыворотку мыши в титре 1 : 15) при 37°С 30 мин. После инкубации ЭБ вновь отмывают при том же режиме.
Смешивают рабочую взвесь лимфоцитов с отмытыми эритроцитами барана (ЕАС-комплекс) в соотношении 1 :50. При слабом перемешивании инкубируют 30 мин при 37°С. Подсчет розеток проводят в камере Горяева или готовят препараты на стекле, как при определении Т-лимфоцитов.
Контроль: для выявления спонтанных агглютинатов эритроцитов, похожих на розетки, эритроциты параллельно инкубируют без добавления лимфоцитов.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ В ОДНОМ ПРЕПАРАТЕ
(МЕТОДОМ Е-РОК И ЗСЗ-РОК).
Принцип.
Лимфоциты, способные к образованию Е-розеток (Т-лимфоциты) и Сз-связей (В-лимфоциты), могут быть выявлены в одном препарате при смешивании лимфоцитов, ЭБ и комплекса зимозан- третий фрагмент комплемента (ЗСз-комплекс).
Реактивы.
1. Зимозан.
2. ЗФР pH 7,41.
3. ЭТС.
4. ЭБ.
5. Комплемент (сухая сыворотка) или свежая сыворотка мыши (титр 1 : 15).
6. Среда Игла (фабричная).
Ход определения.
Подготовка ЗСз-комплекса. 5 мл 0,1%-ной взвеси зимоза-на в дистиллированной воде прогревают на водяной бане при 80°С 30 мин, центрифугируют при 1000 g 10 мин, отмывают ЗФР и ресуспендируют в 5 мл ЗФР. Ампулу комплемента растворяют в 5 мл ЗФР, смешивают с 5 мл суспензии зимозана, инкубируют при 37°С 30 мин. Дважды отмывают ЗФР, ресуспендируют в 3 мл ЗФР или среды Игла. Получается 0,17%-ная взвесь зимозана, обработанного комплементом (ЗСз-комплекс).
Равные объемы рабочей взвеси лимфоцитов, ЗС3 и 0,5%-ной взвеси ЭБ смешивают в пробирке, выдерживают при 20—22°С 25 мин, после чего центрифугируют при 250—300 g 5 мин и инкубируют при 4°С 15—18 ч. Фиксируют глу-таровым альдегидом, отмывают, готовят препараты на стекле, фиксируют и красят, любым стандартным гематологическим методом.
Под иммерсией светового микроскопа находят не менее 200 лимфоцитов, считая Т-лимфоцитами клетки, присоединившие три и более ЭБ (Е-РОК); В-лимфоцитами — присоединившие три и более частиц зимозана (ЗСз-РОК). Выводят процент Е-РОК и ЗС3-РОК.
Клинические значения показателей.
|
|
|
|
|
| |
 |
