Метод розеткообразования для определения Т- и В-лимфоцитов
в периферической крови.
Принцип.
Поверхностные рецепторы, специфичные для различных субпопуляций лимфоцитов, проявляются, связывая эритроциты, нативные или нагруженные антителами к этим рецепторам. Эритроциты образуют с поверхностью лимфоцита фигуру розетки. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3-5 эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно окутывают лимфоцит, образуя так называемую морулу. Интерпретация этого феномена крайне разноречива. Нередко он отражает методические неточности постановки. Феномен розеткообразования может быть усилен путем обработки эритроцитов нейраминидазой.
Определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
Принцип.
Тимусзависимые Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: Erythrocyte — розеткообразующие клетки).
Приборы и оборудование.
1. Центрифуга ЦЛК-1.
2. Холодильник (бытовой).
3. Термостат.
4. Микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы).
5. Камера Горяева.
6. Счетчик клеток.
7. Автоматические пипетки или микропипетки.
8. Пробирки силиконированные или пластиковые.
9. Штатив для пробирок.
Реактивы.
1. Среда 199, раствор Хенкса.
2. Гепарин (готовят раствор из расчета 25 ЕД/мл крови).
3. Фосфатный буфер рН 7,4.
4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого.
5. 0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипанового синего на дистиллированной воде.
6. Гипак (изопак, верографин, уротраст).
7. Фиколл400 (полисахарид с молекулярной массой 400000).
8. Эритроциты барана.
Ход определения.
10 мл крови из локтевой вены вносят в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1:2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин.
В связи с тем что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400 g. Величину центробежного ускорения G вычисляют по формуле:
G= 1,1 *n2* R-10-5 (n — число оборотов в минуту, R — радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-гипака с разделяемой суспензией в см).
После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором. Концентрацию клеток доводят до 2—4 млн. в 1 мл в "среде 199"', содержащей 10 % раствор телячьей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы крови человека. При использовании последней необходима инактивация при 56 °С в течение 30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют
Можно использовать любой буферный раствор рН 7,0—7,2 без ионов Ca++ (наличие ионов Ca++ способствует конгломерации клеток, их коагуляции).
к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, периодически встряхивая. Желательна абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учитывая возможность наличия антилейкоцитарных антител. При использовании человеческой сыворотки необходимо учитывать влияние аутоцитолимфотоксинов, проявляющих максимум активности при 4°С.
Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1 % раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением и 1—2 капли добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3.
Приготовление эритроцитов барана.
Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при 4 °С в растворе Олсвера (глюкоза — 2,05 г, цитрат натрия — 0,8 г, хлорид натрия — 0,42 г, дистиллированная вода—100 мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10 % раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3—4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5 % (по объему) взвесь клеток.
Подготовка и учет реакции розеткообразования.
Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева. Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакций в другой, свободной от постановки или менее загруженный, день. Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов барана, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови человека. Не исключено, что глутаровый альдегид десеквестрирует скрытые антигены в мембране бараньих эритроцитов, к которым имеются рецепторы у лимфоцитов человека. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение Т-лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями.
Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.
В день взятия крови на Т-лимфоциты необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные значения Т-клеток.
Нормальные величины Т-клеток, определенные у 150 здоровых доноров: 54,3 ± 0,98%; 979,8 ± 16,8 кл/мкл.
Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (ЕА-РОК).
Все подготовительные операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 °С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) в течение 5 мин проводили подсчет Т-активных лимфоцитов способом, описанным выше для общих Т-клеток.
Содержание Т-активных лимфоцитов у 150 здоровых доноров составило: 34,6± 1,92 %, 840 ± 123 кл/мл.
| 
