Окраска включений в бактериях.
Краска Нейссера:
а) метиленового синего 0,1 г, 95° спирта 2 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл;
б) раствор хризоидина, везувина или бисмар браун: красителя 1 г, дистиллированной воды 300 мл. Краситель растворяют в кипящей воде и фильтруют через бумагу.
Окраска по Нейссеру для выявления зернистости дифтерийных палочек.
В растворе метиленового синего держат 1 минуту, в растворе Люголя—1 минуту.
Промывают водой. Докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмарк-браун) 1—3 минуты. Промывают водой.
Тела бактерий окрашиваются в нежно-желтый цвет, зерна Бабеша — Эрнста—в темно-синий.
Окраска по Мейеру.
Одновременно из исследуемых бактерий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или 5—15 минут в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 минут метиленовым синим Леффлера и затем один помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой - в 4% водный раствор поташа. Через 5 минут препараты сушат фильтровальной бумагой (не промывать!). Препарат, обработанный кислотой, докрашивают 0,2% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2-3 капля и крепкой уксусной кислоты или хризоидином. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина - в вишнево-красный. В препарате, обработанном щелочью, волютин обесцвечен — пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий.
Окраска по Раскиной.
На препарат наливают краситель, состоящий из карболового фуксина Циля -4 мл, насыщенного раствора метиленового синего-4 мл, ледяной уксусной кислоты-5 мл, 95° спирта-95 мл, дистиллированной воды -до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем промывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий.
Окраска капсул.
Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностическое значение. В мазках из органов или из тканей жидкости капсулы можно обнаружить при помощи гростой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты.
Окраска по Бурри.
На середине предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы, жгутики.
Окраска по Ольту.
Приготовляют ex tempore 2% раствор сафранина в горячей воде и фильтруют его. Фиксированный мазок окрашивают сафранином при подогревания в течение 1-2 минут. Промывают, высушивают. Препарат рассматривают в воде: на мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, на него кладут иммерсионное масло. Тело бактерии и капсула различно преломляют лучи света. Эта разница усиливается при прохождении лучей через слой воды.
Тела микробов окрашиваются в оричнево-красный цвет, капсулы -в бледно-желтый.
Окраска по Антони.
Мазок красят (без фиксации!) на холоду 1% водным раствором кристалвиолета 2 минуты. Затем промывают 20% водным раствором CuSO4 и высушивают фильтровальной бумагой. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы - в сине-фиолетовый.
Окраска по Гиссу.
Препарат, фиксированный любым способом, кроме жара, красят 5% водным раствором генцианвиолета, подогрева до появления паров. Мазок промывают 20% водным раствором медного купороса и сушат. Бактерии и капсулы окрашиваются в фиолетовый, цвет.
Окраска по Гинсу.
Мазок, покрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, метиловым спиртом или на пламени. После промывки водой красят 5-10 минут карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают.
Бактерии фиолетовые или красные. Фон черный. Капсулы неокрашенные!
Окраска спор.
Наиболее простой метод подобен окраске кислотоустойчивых бактерий. Препарат, приготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1—2 минуты карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% раствор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего.
Споры окрашивают в красный цвет.
Способ Ожешки.
На нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают 1—2 минуты. С препарата сливают кислоту, промывают его водой и после высыхания фиксируют на пламени.
Фиксированный препарат красят по способу Циля — Нильсена. В результате тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры — в красный
Окраска по Биттеру.
Нефиксированный мазок, обработанный 10% раствором формалина (10 минут), промытый водой и высушенный, красят аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего, 3 мл крепкого NH4OH и 80 мл дистиллированной воды) 3 минуты, нагревая стекло до закипания жидкости. После промывания водой и высушивания докрашивают мазок везувином или сафранином 3—5 минут. Вновь промывают, высушивают и микроскопируют. В окрашенном этим способом мазке бактерийные тела красные или буро-желтые (в зависимости от краски, примененной для докрашивания), споры синие.
Метод Шеффера и Фултона.
На препарат, фиксированный жаром, наносят 5% водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появления паров 3—4 раза. Мазок промывают и докрашивают 30 секунд 0,5% водным раствором сафранина. При этой окраске споры зеленые, а клетки красные.
Метод Пешкова.
На мазок, фиксированный жаром (над пламенем!), наливают синьку Леффлера и подогревают стекло до закипания краски. Дают 15—20 секунд покипеть, а затем (после того как стекло остынет!) промывают водой и докрашивают препарат 30 секунд 0,5% водным раствором нейтральрота. Вновь промывают, сушат и микроскопируют; споры голубые, клетки розовые.
Окраска жгутиков.
Это одна из наиболее трудных процедур в бактериологической технике, так как жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата. Поэтому здесь требуется особая тщательность работы. Стекла для препаратов должны быть абсолютно чисты и обезжирены. Обычно работают с новыми покровными стеклами, которые предварительно кипятят в течение 10 минут в хромовой смеси (двухромовокислого калия 20 г, воды 200 мл, серной кислоты 20 мл; приливать в указанном порядке). После кипячения стекол хромовую смесь сливают, промывают стекла 5 минут в слабом растворе едкого натра, после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и хранят в спирте (во время промывания не прикасаться к стеклам руками). Перед употреблением стекла вынимают из спирта чистым пинцетом и удаляют спирт обжиганием (ничем не вытирать!).
Исследуемая культура должна быть не старше 12—18 часов. Материал берут осторожным прикосновением петли к культуре и вносят в пробирку с несколькими миллилитрами водопроводной воды, погружая петлю в воду и держа ее неподвижно некоторое время. Повторяют это 2—3 раза, пока не получится тонкая, лишь слегка опалесцирующая взвесь. Полученной взвеси дают постоять 15—20 минут в термостате для равномерного распределения микробов в воде. Затем платиновой петлей кладут каплю из нее на покровное стекло. Если стекло достаточно чисто, капля принимает правильную круглую форму, легко расплывается и быстро высыхает на воздухе без подогревания. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски.
Серебрение по Морозову.
Приготовляют 3 реактива:
1) 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл продажного формалина + 100 мл дистиллированной воды;
2) 5 г танина + 1 мл жидкой карболовой кислоты (liquefaciens) + 100 мл дистиллированной воды;
3) 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной водой 1:10.
Окраска препарата: наливают на 1 минуту первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 минуту), тщательно промывают водой, 1—2 минуты при подогревании обрабатывают препарат третьим реактивом до появления темно-коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.
Метод Бениньетти.
Готовят 3 раствора за 2—3 дня до окраски:
1) сульфата цинка 1 г, танина 15 г, дистиллированной воды 100 мл.
2) насыщенный горячий водный раствор квасцов;
3) насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета.
Непосредственно перед окраской растворы смешивают в пропорции 1-й, 2-й, 3-й = 5:5:3. Наливают на фиксированный мазок смешанную краску и подогревают над пламенем 2—3 минуты до появления паров. Тщательно обмывают водой и просушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.
Метод Леффлера.
За 1—2 суток до употребления готовят протраву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 20% водного раствора танина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сернокислого закисного аммиачного железа (соль Мора). Перед употреблением фильтруют.
Препарат, приготовленный на покровном стекле, фиксируют и помещают на часовое стекло.
Наливают протраву и 30—50 секунд подогревают до отхождения паров. Дав стеклу остыть, его промывают водой и, поместив на другое часовое стекло, красят фуксином Циля 2—3 минуты при слабом подогревании.
После тщательной промывки и высушивания препарат готов для микроскопирования.
Метод Шенка.
Протраву, состоящую из двух растворов, готовят за 7—10 дней до употребления.
Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% водного раствора полуторахлористого железа, второй — из 1 мл анилина и 4 мл 95° спирта.
Протраву готовят на препарате, для чего на него наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на препарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хорошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы.
Метод Грея.
Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления.
Растворы состоят из:
1) насыщенного водного раствора калийных квасцов KAl(S04)2 *12Н20 — 5 мл, 20% водного раствора танина — 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути HgCl2 —2 мл;
2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 0,4 мл.
Протраву наливают на препарат на 8-10 минут, затем промывают его дистиллированной водой и окрашивают 5 минут карболовым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
Метод Петрука.
Является модификацией метода Грея. Вместо карболового фуксина применяют азотнокислое серебро, раствор которого готовят следующим образом: 1 г AgN03 растворяют в 20 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавляют 5% раствор аммиака до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Этот исходный раствор разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и применяют для окраски. Препарат с нанесенным на него раствором азотнокислого серебра слегка подогревают над пламенем. Жгутики окрашиваются в желто-коричневый цвет.
Окраска клеточной стенки.
При обычных методах окраски мазков клеточная стенка не окрашивается. Поэтому применяют специальные методы с протравами.
Метод Гутштейна.
Препарат, 1—2 часа фиксированный в жидкости Буэна, 2—3 минуты подвергают действию протравы (5—10/0 водный раствор танина), ополаскивают водой и затем микроскопиругот в капле 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.
Метод Кнайзи.
Препарат, фиксированный жаром, обрабатывают 3—5 минут протравой, состоящей из 70 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20% водного раствора танина. На мазок, промытый водой, наносят каплю карболового фуксина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, не удаляя краску.
Метод Пешкова.
Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: 90° спирта 60 мл, хлороформа 30 мл и уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2—5 минут в 10% водном растворе танина. Затем препарат промывают водой, красят 30—60 секунд фуксином Пфейффера и, не промывая, сушат и микроскопиругот.
Окраска ядерных элементов.
Метод Романовского.
Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом, жидкостью Карнуа или смесью Никифорова. Окрашивают рабочим раствором красителя (2 капли продажного красителя Гимзы на 1 мл дистиллированной воды) 10—20 минут. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют.
Дистиллированная вода, применяемая для разведения красителя, должна иметь нейтральное значение рН, так как от этого в высокой степени зависят результаты окрашивания. Реакция дистиллированной воды, кроме обычно применяемых с этой целью способов, может быть проверена путем прибавления к ней кристаллика гематоксилина или нескольких капель его спиртового раствора. Вода пригодна если в течение 2 минут не появляется розовая окраска; в противном случае она кислая и должна быть подщелочена 1% раствором углекислой соды (NaHC03).
При микроскопии ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма—слабо розовый.
Метод Пикарского.
Препарат обрабатывают 1 N НС1 7 минут при подогревании до 60". После промывания мазок окрашивают по Романовскому. После окраски ядерные элементы темно-красные, протоплазма розовая.
| 
