Белое вещество полушарий головного мозга исследуется в пределах от границы VI слоя коры до условной линии, соединяющей основание извилины с фундальными отделами расположенных рядом борозд.
Вырезку гиппокампа следует проводить таким образом, чтобы в препарате определялись основные структурные поля гиппокампа (СА1-СA3). Морфометрическую оценку состояния клеток микроглии в гиппокампе следует проводить в слое Alveus, а также в молекулярном слое аммонова рога и зубчатой фасции.
Технология использования иммуногистохимического метода определения экспрессии CD68
I этап — депарафинирование и обезвоживание
1. Поместить стекла с парафиновыми срезами последовательно в две порции ксилола на 10 мин.
2. Стекла поместить последовательно в три порции этанола 96% на 3 мин.
3. Промыть срезы в трех порциях дистиллированной воды и поместить последовательно в две порции дистиллированной воды на 5 мин в каждую.
II этап — предобработка с целью демаскировки антигенов, направленная на восстановление структуры белка, которая изменилась в ходе фиксации и заливки в парафин
1. Поместить срезы в емкость с демаскировочным буфером рН = 6,0 и погрузить на 10 мин в водяную баню при температуре 96-99°С.
2. После демаскировки оставить емкость со срезами при комнатной температуре на 20 мин.
3. Промыть срезы в двух порциях дистиллированной воды по 5 мин.
4. Поместить срезы в 3% раствор перекиси водорода на 20 мин.
5. Промыть в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин.
III этап — проведение иммуногистохимической реакции
1.Срезы обвести карандашом для ИГХ.
2. Нанести первичное антитело (анти-CD68), разведенное согласно указаниям производителя в буфере для разведения специфических антител. Слайды разместить горизонтально в герметичной емкости, дно которой покрыть фильтровальной бумагой, смоченной водой. Емкость поместить в холодильник на ночь.
3. Слить со срезов жидкость.
4. Срезы промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.
5. Нанести на срезы визуализирующую систему на полимерной основе к мышиным или кроличьим антителам, или универсальную (к мышиным и кроличьим антителам) на 30 мин.
6. Промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.
7. Нанести раствор ДАБ, приготовленный в соответствии с рекомендациями изготовителя непосредственно перед нанесением на срезы, инкубировать 6-8 мин. Длительность инкубации в ДАБ устанавливается в каждой лаборатории индивидуально, для чего необходимо наблюдать процесс появления коричневого окрашивания под микроскопом. Время окрашивания считается достаточным, если структуры, подлежащие окрашиванию, приобрели ярко-золотисто-коричневый цвет, в то время как фоновое окрашивание стромальных компонентов отсутствует.
8. Слить со срезов жидкость и промыть дистиллированной водой.
9. Срезы докрасить гематоксилином Майера. Время окрашивания зависит от качества и степени зрелости гематоксилина и составляет 40-60 с.
10. Промыть дистиллированной водой.
IVэтап — просветление и заключение срезов
1. Обезвоживание в спиртах.
2. Просветление в ксилоле.
3. Заключение в канадский бальзам.
Для контроля активности первичных антител в каждой серии необходимо проведение одного отрицательного и одного положительного контрольного окрашивания. В качестве отрицательного контрольного окрашивания срезы вместо инкубации с первичным антителом покрываются 1% раствором сывороточного альбумина. В качестве положительного контроля для антител к CD68 могут быть использованы случаи церебральной патологии с известной высокой экспрессией данных маркеров в ткани головного мозга. Окраска расценивается как положительная только при отсутствии окрашивания в отрицательном контрольном препарате и как отрицательная — при наличии окрашивания в положительном контрольном препарате.
| 
