МЕТОД МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

МИКРОГЛИОЗА В БЕЛОМ ВЕЩЕСТВЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА

инструкция по применению


В настоящей инструкции по применению (далее — инструкция) предложен метод морфологической диагностики и оценки микроглиоза в белом веществе головного мозга при различных заболеваниях на основе иммуногистохимического выявления биохимического маркера микроглии.

Настоящая инструкция предназначена для врачей-патологоанатомов, врачей-нейро- и онкоморфологов.


ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИГХ — иммуногистохимия

CD68 — рецептор к клеткам микроглии

ДАБ — диаминобензидин


ПЕРЕЧЕНЬ НЕОБХОДИМОГО ОБОРУДОВАНИЯ, РЕАКТИВОВ, СРЕДСТВ, ИЗДЕЛИЙ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ


Оборудование

1. Микротом с возможностью изготовления гистологических срезов толщиной не более 4 мкм.

2. рН-метр.

3. Термостат.

4. Автоматические пипетки переменного объема.

5. Баня водяная с датчиком температуры.

6. Световой микроскоп.

7. Таймер/секундомер.


Реактивы и расходные материалы

1. Предметные стекла для ИГХ (или предметные стекла предварительно обработанные поли-L-лизином или силаном).

2. Покровные стекла.

3. Лабораторная посуда (колбы, пробирки, стеклянные палочки, воронки, стаканы, контейнеры для предметных стекол).

4. Ксилол.

5. 96% спирт.

6. Перекись водорода 3%.

7. Tris-HCI — отмывочный буфер, рН = 7,5.

8. Буфер для разведения специфических антител.

9. Буфер для демаскировки антигенов, рН = 6,0.

10. Карандаш для ИГХ.

11. Раствор ДАБ.

12 .Первичные моноклональные антитела к CD68 (клон КР1). Обязательным условием является наличие в спецификации указания о возможности использования на формалин-фиксированных тканях человека.


ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ

Заболевания и патологические состояния, сопровождающиеся микроглиозом в белом веществе головного мозга.


ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ

Отсутствуют.


ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Забор материала для исследования

Головной мозг извлекается из черепа, помещается в раствор 10% нейтрального формалина и фиксируется в течение 7 дней. Для исследования берут по 1 фрагменту из симметричных участков правой и левой лобной, теменной, височной и затылочной долей головного мозга, а также 2 фрагмента симметрично из гиппокампа (рис.).



Рис. — Схематичное отображение участков забора материала для исследования



Белое вещество полушарий головного мозга исследуется в пределах от границы VI слоя коры до условной линии, соединяющей основание извилины с фундальными отделами расположенных рядом борозд.

Вырезку гиппокампа следует проводить таким образом, чтобы в препарате определялись основные структурные поля гиппокампа (СА1-СA3). Морфометрическую оценку состояния клеток микроглии в гиппокампе следует проводить в слое Alveus, а также в молекулярном слое аммонова рога и зубчатой фасции.


Технология использования иммуногистохимического метода определения экспрессии CD68


I этап — депарафинирование и обезвоживание

1. Поместить стекла с парафиновыми срезами последовательно в две порции ксилола на 10 мин.

2. Стекла поместить последовательно в три порции этанола 96% на 3 мин.

3. Промыть срезы в трех порциях дистиллированной воды и поместить последовательно в две порции дистиллированной воды на 5 мин в каждую.


II этап — предобработка с целью демаскировки антигенов, направленная на восстановление структуры белка, которая изменилась в ходе фиксации и заливки в парафин

1. Поместить срезы в емкость с демаскировочным буфером рН = 6,0 и погрузить на 10 мин в водяную баню при температуре 96-99°С.

2. После демаскировки оставить емкость со срезами при комнатной температуре на 20 мин.

3. Промыть срезы в двух порциях дистиллированной воды по 5 мин.

4. Поместить срезы в 3% раствор перекиси водорода на 20 мин.

5. Промыть в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин.


III этап — проведение иммуногистохимической реакции

1.Срезы обвести карандашом для ИГХ.

2. Нанести первичное антитело (анти-CD68), разведенное согласно указаниям производителя в буфере для разведения специфических антител. Слайды разместить горизонтально в герметичной емкости, дно которой покрыть фильтровальной бумагой, смоченной водой. Емкость поместить в холодильник на ночь.

3. Слить со срезов жидкость.

4. Срезы промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.

5. Нанести на срезы визуализирующую систему на полимерной основе к мышиным или кроличьим антителам, или универсальную (к мышиным и кроличьим антителам) на 30 мин.

6. Промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.

7. Нанести раствор ДАБ, приготовленный в соответствии с рекомендациями изготовителя непосредственно перед нанесением на срезы, инкубировать 6-8 мин. Длительность инкубации в ДАБ устанавливается в каждой лаборатории индивидуально, для чего необходимо наблюдать процесс появления коричневого окрашивания под микроскопом. Время окрашивания считается достаточным, если структуры, подлежащие окрашиванию, приобрели ярко-золотисто-коричневый цвет, в то время как фоновое окрашивание стромальных компонентов отсутствует.

8. Слить со срезов жидкость и промыть дистиллированной водой.

9. Срезы докрасить гематоксилином Майера. Время окрашивания зависит от качества и степени зрелости гематоксилина и составляет 40-60 с.

10.   Промыть дистиллированной водой.


IVэтап — просветление и заключение срезов

1. Обезвоживание в спиртах.

2. Просветление в ксилоле.

3. Заключение в канадский бальзам.


Для контроля активности первичных антител в каждой серии необходимо проведение одного отрицательного и одного положительного контрольного окрашивания. В качестве отрицательного контрольного окрашивания срезы вместо инкубации с первичным антителом покрываются 1% раствором сывороточного альбумина. В качестве положительного контроля для антител к CD68 могут быть использованы случаи церебральной патологии с известной высокой экспрессией данных маркеров в ткани головного мозга. Окраска расценивается как положительная только при отсутствии окрашивания в отрицательном контрольном препарате и как отрицательная — при наличии окрашивания в положительном контрольном препарате.





Яндекс.Метрика
Система Orphus