Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.
Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.
В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.
Метод I.
Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.
1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 — 5 дней в 0,75 — 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.
2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 — 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.
5. Заливают в целлоидин или парафин.
Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.
Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих—3 %, у беспозвоночных—6 % раствор. На 2—3 кусочка расходуют 80—100 мл раствора.
Метод II.
Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.
1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.
2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1,5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.
3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.
6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).
В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 — 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.
Метод III.
Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.
Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1—12 капель (для большого мозга 1—3 капли, мозжечка—4, спинного и продолговатого мозга—8—12, периферических окончаний — 2 —3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2—4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.
Метод IV.
Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.
Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 — 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.
Метод V.
Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).
Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12—24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.
Метод VI.
Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.
Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 — 24 ч в проточной воде и 2 — 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.
Импрегнация замороженных срезов.
Метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия.
1. Материал фиксируют в формалине (1:4) 3 дня или дольше.
2. Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин.
3. После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2 % раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97 % спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем.
4. Отдельные срезы на 2—4 с погружают в 100 % спирт.
5. Восстанавливают 1—3 мин в смеси, в состав которой входят 0,3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона.
6. Основательно промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно.
7. Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой.
8. Проводят через 100 % спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам.
В том случае, если с помощью этого метода не удается выявить мякотные волокна белого вещества, то перед серебряной ванной замороженные срезы 2 ч обрабатывают в смеси, состоящей из 10 мл 100 % спирта, 10 мл дистиллированной воды и 8-10 капель аммиака. Затем промывают, помещают в раствор нитрата серебра с пиридином и т.д.
Метод Рамона—Лермитта
(выявление дегенерированных синапсов)
Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.
1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).
2. Промывают в дистиллированной воде.
3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.
4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.
5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.
6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены)
7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.
8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.
| 
