Ускоренный метод окрашивания миелиновых волокон и нервных клеток по Викторову
Депарафинированные срезы окрашивают в течение 1 —2 ч в 0,01 % кислом спиртовом растворе люксолевого синего прочного, дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия (буры) и докрашивают крезиловым фиолетовым прочным по Нисслю.
Растворы красителей и их изготовление.
Раствор I: 1 г люксолевого синего прочного, 5 мл ледяной уксусной кислоты, до 100 мл 96 % спирта. Для приготовления рабочего 0,01 % раствора
1 мл основного раствора красителя смешивают со 100 мл 96 % спирта. Рабочий раствор красителя можно использовать повторно.
Раствор II: 250 — 500 мг крезилового фиолетового прочного, 130 мг ацетата натрия, 1,2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Забуференный раствор крезилового фиолетового прочного для подкрашивания по Нисслю можно использовать неоднократно.
Методика окраски
1. Наклеенные на стекла парафиновые срезы толщиной 10 — 20 мкм депарафинируют в ксилоле и промывают в 100 % и 96 % спиртах.
2. Окрашивают в 0,01 % спиртовом растворе люксолевого синего прочного 1 — 2 ч при 56 — 60 °С.
3. Промывают срезы последовательно в 96 % и 70 % спиртах и дистиллированной воде.
4. Дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия, контролируя процесс под микроскопом (краситель постоянно удаляется из среза, а миелиновые волокна сохраняют яркую сине-зеленую окраску).
5. Ополаскивают в 5 % растворе уксусной кислоты.
6. Окрашивают крезиловым фиолетовым прочным в течение 2 — 5 мин.
7. Промывают в дистиллированной воде.
8. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: миелин ярко-синего цвета; вещество Ниссля, ядра нейронов, глиоцитов, клеток сосудов и оболочек мозга фиолетовые.
Метод избирательной импрегнации дегенерированных нервных волокон и окончаний
Фиксацию мозга лабораторных животных проводят методом прижизненной перфузии 10 % раствором нейтрального формалина на изотоническом растворе хлорида натрия через левый желудочек сердца. После перфузии мозг дополнительно фиксируют в течение 10—14 дней в 10 % растворе нейтрального формалина, а за 1 — 2 дня перед резкой помещают в 30 % раствор сахарозы, что предупреждает повреждение ткани при замораживании. В растворе формалин-сахарозы мозг может храниться долго.
Срезы толщиной 25 — 40 мкм, полученные на замораживающем микротоме, собирают в 10 % раствор формалина, в котором и хранят до последующей обработки.
Растворы и их приготовление.
А. Кислый раствор соли пятивалентного ванадия: навеску в 1,2 г метаванадата аммония (аммоний ванадиевокислый) растворяют в 150 — 200 мл горячей дистиллированной воды, после охлаждения раствора к нему добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Удобно готовить также концентрированный раствор: 12 г метаванадата аммония растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды. К полученному раствору после охлаждения небольшими порциями добавляют 50 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Если при добавлении серной кислоты выпадает бурый осадок пятиокиси ванадия, то его растворяют при нагревании. Перед применением к 1 части концентрированного раствора добавляют 9 частей дистиллированной воды. Кислый раствор метаванадата аммония может храниться в течение длительного времени.
Б. Раствор нитрата серебра 3 %.
В. Аммиачно-натриевый раствор: в 100 мл 25 % водного раствора аммиака растворяют 1,25—1,5 г гидроксида натрия. Раствор хранят в плотно закрытой склянке с полиэтиленовой пробкой.
Г. Раствор аммиачного серебра (готовят перед использованием): к 50 мл 3 % аммиачного серебра добавляют 6 мл аммиачно-натриевого раствора.
Д. Редуцирующий раствор: 27 мл 10 % формалина, 87 мл 1 % лимонной кислоты, 90 мл 96 % спирта, до 1000 мл дистиллированной воды.
Е. Смесь равных объемов 1 % раствора тиосульфата натрия и 1 % раствора сульфита натрия.
Импрегнация срезов
1. Срезы промывают в течение 5 мин в 2 сменах дистиллированной воды.
2. Помещают в кислый раствор метаванадата аммония на 10— 15 мин.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды 5 мин.
4. Переносят на 25 — 30 мин в 3 % раствор нитрата серебра (срезы приобретают светло-коричневый цвет). Далее каждый срез обрабатывают отдельно.
5. Ополаскивают в дистиллированной воде (5— 10 смен).
6. Помещают на 1 — 2 мин в раствор аммиачного серебра.
7. Без предварительного промывания проводят через 2 смены редуцирующего раствора (1-я смена — 1 мин, 2-я смена — 2 — 3 мин).
8. Промывают 1 — 2 мин в дистиллированной воде.
9. Помещают на 1 — 2 мин в смесь равных объемов 1 % растворов тиосульфата натрия и сульфита натрия.
10. Тщательно промывают в 2 сменах дистиллированной воды в течение 10—15 мин.
11. Промытые срезы наклеивают на предметные стекла спиртовым раствором желатина и хромовых квасцов (в 200 мл 0,5 % раствора желатина растворяют 100 мг хромовых квасцов; чистые предметные стекла погружают в этот раствор, вынимают и сушат в вертикальном положении). Наклеенные и хорошо просушенные срезы обезвоживают спиртом, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Примечания. 1. Продолжительность обработки срезов, описанной в пунктах 2, 4, 6, определяют опытным путем для каждой серии срезов.
2. Качество препаратов значительно улучшается, если срезы, наклеенные на предметные стекла, докрасить растворами крезилового фиолетового прочного или толуидинового синего.
Результат: фон препаратов светло-желтый, реже коричневый; дегенерированные волокна — черные; в местах окончания дегенерированных волокон выявляют тела нервных клеток и ядра нейроглии, имеющие различные оттенки фиолетового цвета.
Методика дифференцированного выявления нейронов и глии на парафиновых срезах
Гистохимические методы, в частности методы определения белковых веществ, не позволяют дифференцировать типы глии, поскольку обычно у глиальных клеток различимы только структуры ядра. Ставя задачу разработать метод дифференцированного определения нейронов и глиальных элементов на гистохимических препаратах, авторы попытались объединить метод Альцгеймера, предназначенный для выявления митохондрий, нейросом, телец Ниссля и астроцитарной глии, и гистохимический метод определения общего белка с применением амидо черного 10Б. Метод Альцгеймера основан на различном сродстве органоидов клетки к красителям: в нейронах митохондрии и нейросомы окрашиваются в ярко-красный цвет, вещество Ниссля — в зеленый, а тела амебовидных клеток — в зеленоватый, глиальные и соединительнотканные волокна — в красный. Метод с применением амидо черного 10Б позволяет обнаружить общий и суммарный белок в ткани мозга по окрашиванию его скоплений в зеленый цвет. В результате исследования разработана следующая схема.
Кусочки ткани мозга после фиксации в жидкости Карнуа проводят по обезвоживающим средам и заключают в парафин. Срезы толщиной 5—10 мкм приклеивают белком на предметные стекла.
1. Срезы депарафинируют и через спирты нисходящей концентрации доводят до воды.
2. Переносят в 0,03 % раствор амидо черного 10Б на ацетатном буфере (рН 5,32) при комнатной температуре на 20 мин.
3. Промывают в дистиллированной воде.
4. Инкубируют в насыщенном водном растворе кислого фуксина при 56 °С 30 мин.
5. После охлаждения до комнатной температуры ополаскивают в дистиллированной воде.
6. Дифференцируют в пикриновой кислоте (15 мл насыщенного спиртового раствора пикриновой кислоты и 30 мл дистиллированной воды) 15 с.
7. Ополаскивают в дистиллированной воде и обсушивают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют в 100 % спирте около 2,5 с.
9. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: отчетливо выявляются белки в телах и митохондриях нейронов, а также в ядрах глиальных клеток. Последние значительно различаются по интенсивности окраски в зависимости от принадлежности к тому или иному типу глии: кариоплазма и хроматиновые структуры ядер олигодендроглиоцитов интенсивно-красного цвета, а у астроцитов в красный цвет окрашены ядрышко и небольшое количество зерен хроматина.
Метод Герлаха
Для выявления грубых отростков ганглиозных клеток и более крупных тяжей волокон рекомендуется метод Герлаха. При этом важно, чтобы препараты до окрашивания кармином не соприкасались со спиртом.
Материал фиксируют в жидкости Мюллера или 3 — 5 % растворе бихромата калия. Продолжительность фиксации мозга птиц и лягушек составляет несколько недель, головного и спинного мозга человека — несколько месяцев и даже лет. Срезы получают на замораживающем микротоме и в течение нескольких часов промывают в воде. Окрашивают в разбавленном растворе аммиачного кармина 24 — 48 ч. Очень важно правильно приготовить раствор: растирают 1 г кармина, приливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют по каплям 26 % раствор аммиака (нашатырный спирт) в таком количестве, чтобы краситель полностью растворился. После этого раствор должен созреть в открытом сосуде до полного исчезновения запаха аммиака. К употреблению годны лишь растворы, стоявшие в течение длительного времени. Перед использованием основной раствор разбавляют дистиллированной водой настолько, чтобы для окрашивания срезов потребовалось 24 — 48 ч. Раствор кармина можно использовать повторно (со временем он даже становится лучше). Срезы дифференцируют в слабо подкисленной уксусной кислотой воде 1 — 2 ч; промывают, проводят через спирты возрастающей концентрации, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: ганглиозные клетки с отростками интенсивно-красные; осевые цилиндры нервных волокон и ядра клеток красные; волокна глии розовые; мякотные оболочки остаются неокрашенными. Если срез предварительно окрасить гематоксилином, то ядра окрашиваются контрастно в синий цвет.
Метод аксонального электрофореза солей кобальта для исследования мозга млекопитающих
Создание метода заполнения нервных структур солями кобальта (Со-метод) у позвоночных животных [Ри11ег Р.М., Рпог 1975] открыло широкие возможности для избирательного окрашивания определенных систем нервных клеток и волокон, напоминающего импрегнацию по методу Гольджи.
Метод отрабатывали на корешках тройничного, языкоглоточного и блуждающего нервов взрослых крыс и латеральном обонятельном тракте котов при пропускании тока 5 — 50 мкА и длительности электрофореза 2 —24 ч.
1. Животное умерщвляют внутрибрюшинным введением наркотических веществ. Все дальнейшие процедуры до окончания эксперимента обязательно проводят на холоде и используют холодные растворы (4 °С). Мозг перфузируют через сердце 200 мл трис-НС1-буфера (рН 7,4), содержащего 154 мМ хлорида натрия, 5,6 мМ хлорида калия, 2,3 мМ хлорида кальция и 0,25 М сахарозы, быстро и осторожно достают из черепной коробки и помещают в фарфоровую чашку с таким же раствором.
2. Аксональный электрофорез солей кобальта: корешок черепного нерва перерезают острым скальпелем, центральный конец корешка или тракта помещают в полиэтиленовую трубку, диаметр которой немного больше диаметра корешка или тракта.
Этот конец фиксируют к стенке клеем МК-6 или вазелином, который одновременно герметически закупоривает трубку с этого конца. С противоположной стороны трубки наливают 130 мМ раствор дихлорида кобальта. Составляют электрическую цепь, в которую последовательно включают батарею постоянного тока (100-АМЦГ-У-190), микроамперметр, реостат и электроды. Один платиновый электрод (плюс) помещают в раствор дихлорида кобальта, другой (минус) — в раствор, омывающий мозг. Пропускают постоянный электрический ток силой 40 мкА в течение 6 ч. В процессе эксперимента через каждый час полностью меняют раствор, омывающий мозг.
3. Осаждение солей кобальта: по окончании эксперимента вырезают подлежащий изучению участок мозга (размером 20х10х5 мм), который для одновременного осаждения Со2+ и фиксирования нервной ткани помещают на 10 ч в смесь, состоящую из 2 мл 10 % сульфида натрия и 100 мл 70 % спирта. При удачном заполнении корешка нерва или тракта почернение его наступает уже через 10 с.
4. Получение гистологических препаратов: после кратковременного промывания в 70 % спирте (10 мин) кусочек мозга обезвоживают в спиртах: 96 % — 1 ч, в 100 % — 1 ч, в 100 % — 2 ч; помещают последовательно в смесь 100 % спирта и хлороформа (1:1) и хлороформ до тех пор, пока он не опустится в каждом из этих растворов на дно сосуда, затем обычным способом заливают в парафин. Мозг режут на непрерывные серийные срезы толщиной 20 — 25 мкм, наклеиваемые белком на стекла. Срезы на стеклах депарафинируют в ксилоле и проводят по спиртам нисходящей концентрации до воды.
5. Усиление осадка сульфида кобальта: для выявления малых количеств кобальта в нервной ткани используют физический проявитель. Срезы на стеклах помещают в чашку Петри, заливают проявителем и ставят в термостат при 37 °С на 20 — 30 мин. Необходимо избегать попадания прямого солнечного света. Окрашивание доожно контролировать визуально и прекращать при появлении слабо-желтого или коричневого фона на стороне введения кобальта путем промывания срезов водой (несколько смен по 5 мин). Затем срезы обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
6. С целью выявления не содержащих кобальт и поэтому не окрашенных нервных элементов срезы можно докрашивать 0,15 % галлоцианином по Ромейсу или 0,2 % крезиловым фиолетовым по Викторову.
7. Все растворы готовят на дистиллированной воде, реактивы должны быть химически чистыми.
Физический проявитель состоит из раствора А — 25 % гуммиарабик, раствора В — 2 % гидрохинон в 5 % растворе лимонной кислоты, раствора С — 10 % раствор нитрата серебра. Растворы А, В и С можно хранить в темном прохладном месте в течение 2 нед. Рабочий раствор готовят непосредственно при проявлении срезов, последовательно смешивая 10 частей А, 10 частей В и 0,2 части С. Гуммиарабик в растворе А можно заменить 4 % раствором желатина и рабочий раствор тогда составляют из 8 частей А, 3 частей В и 0,1 части С.
Результат: сенсорные волокна и их терминальные ветвления заполнены кобальтом и имеют четкие контуры; окрашенные нервные клетки и их аксоны легко отличимы от заметных иногда на препарате в виде теней, не заполненных кобальтом нервных элементов, дендриты можно проследить на расстоянии 100— 150 мкм от тела клетки; набухания и фрагментации волокон, изменения формы и объема нейронов не наблюдается. Весь препарат имеет слабо-желтый фон, окрашенные волокна и клетки черного цвета.
Методика фотооксидации флюоресцентных препаратов секционного материала мозга человека для световой и электронной микроскопии
Для системного выявления нейронов и проводящих путей мозга человека применяют внутриклеточное введение люциферового желтого (ЛЖ) и мембранный транспорт карбоцианиновых красителей, в основном 1,1-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорит (ДИЛ).
1. В секционном материале мозга человека, взятом спустя 7 — 16 ч после смерти, через микроэлектрод вводят Л Ж в пирамидные нейроны зрительной, фронтальной коры и непирамидные нейроны гиппокампа, а карбоцианиновые красители (в основном ДИЛ) — в белое вещество или различные слои зрительной коры.
2. Вибратомные срезы (толщиной 75—150 мкм), окрашенные ЛЖ или ДИЛ, помещают в чашку Петри и прижимают к ее дну металлическим грузом; наливают раствор, состоящий из 1 мг/мл 3,3'-диаминобензидина-4 (ДАБ) и 1 мг/мл цианида калия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4).
3. Для фотооксидации чашку Петри со срезами помещают под флюоресцентный микроскоп. Используют эпифлюоресцен-цию через объективы с увеличением в 6,3 или 10 раз и соответствующие светофильтры: для Л Ж — максимум возбуждения 470 нм, для ДИЛ — 546 нм.
4. Через 1 — 2 ч (время колеблется в зависимости от плотности освещения, толщины препаратов и флюоресцентного вещества) срезы мозга промывают 3 раза фосфатным буфером. Можно проводить несколько процедур фотооксидации на одном и том же срезе, каждый раз меняя раствор.
5. Для проведения световой микроскопии срезы помещают на предметные стекла, смазанные белком, высушивают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
6. Для осуществления электронной микроскопии срезы помещают на 7 — 10 мин в 0,5 % раствор тетраоксида осмия на фосфатном буфере, промывают 3 раза тем же буфером, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заключают между двумя целлофановыми листочками.
7. Срезы, окрашенные ЛЖ, дополнительно контрастируют в урани л ацетате. Срезы, окрашенные ДИЛ, этой процедуре не подвергают, так как в этом случае на электронно-микроскопическом уровне невозможно отличить мембраны, окрашенные ДИЛ, от мембран, контрастированных уранилацетатом.
Результат: выявляются пучки аксонов с коллатералями и бусинками по ходу, очень четко окрашиваются также отдельные терминальные волокна с бусинками по ходу или шипикоподоб-ными образованиями; нейроны выявляются со всеми деталями. На электронограммах нейроны и дендриты, окрашенные ЛЖ, имеют более темный профиль.
Использование метода фотооксидации позволяет преобразовать флюоресцентные препараты в световые, которые также годны для электронной микроскопии.
| 
