Применение гематоксилина в микроскопической технике

Применение гематоксилина в микроскопической технике

© 2008 г. Горбунова Т. К.

 В статье анализируется метод окраски биологических тканей с применением гематоксилина. Рассмотрены наиболее известные прописи приготовления растворов гематоксилина.

Ключевые слова: гематоксилин, гистологическая техника, методы окраски.

Гематоксилин – краситель растительного происхождения (С16Н14О6•3Н2О  М.м. 356,33) (Рис. 1) . Содержится в форме гликозида в соке кампешевого дерева (Haetmatoxylon campechianum), произрастающего в Индии и Америке. Родиной этого дерева является южная Мексика, область Кампече. Для производства красителя кампешевое дерево разводят в Центральной Америке. Выделяют путем экстракции диэтиловым эфиром [12].

Рис.1. Гематоксилин

Свойства. Бесцветные призматические кристаллы сладкого вкуса, приобретающие под действием света, а также на воздухе красновато-желтую окраску. При 120?С препарат теряет кристаллизационную воду, а при 140?С плавится. Мало растворим в холодной воде, растворим в горячей воде (особенно в присутствии буры), этиловом спирте, глицерине, плохо растворим в диэтиловом эфире. Со щелочами дает растворы пурпурного цвета, быстро переходящий в синевато-фиолетовый, а затем в коричневый. Разбавленные кислоты на гематоксилин не действуют. Обладает свойствами кислотно-основного индикатора.

Применение. Кампешевый экстракт, содержащий гематоксилин, изначально применялся для окраски тканей в текстильной промышленности. В качестве гистологического красителя гематоксилин стал применяться с середины XIX века. Гематоксилин, введенный в микротехнику Вальдейером в 1882 году, положил начало разработке ценнейших методов окраски [7]. Первый рецепт квасцового гематоксилина был предложен Бемером в 1865 году. И в XX веке стал главным красителем, применяемый для окраски ядер клеток.

В первом отечественном руководстве по микроскопической анатомии “Основания к изучению микроскопической анатомии человека и животных” под редакцией Лавдовского М. Д. и Овсянникова Ф. В. (1887) [3, 4] гематоксилин занимал второе место после окрасок другим природным красителем – кармином. В “Основах патолого-гистологической техники” Соболева Л. В. (1910) [3,11] метод гематоксилин-эозином занимает первое место среди других. Это говорит о росте популярности методов окраски гематоксилином.

Гематоксилин сам не является красителем, но, окисляясь, превращается в красящий гематеин (Рис. 2), который в свою очередь дает различные продукты окисления, не применимые для окрашивания. Все рецепты приготовления гематоксилина для окрашивания препаратов имеют своей целью превращение гематоксилина в гематеин. Но ни гематоксилин, ни гематеин не способны давать окрашивание без протрав, с которыми они образуют солеобразные соединения – лаки. В качестве протрав используют соли алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия.

Рис. 2.  Гематеин

Красящие растворы, приготовленные из гематоксилина, приобретают способность к окрашиванию лишь через некоторое время: они должны “созреть”. Под “созреванием” понимают процесс превращения гематоксилина в гематеин, которое происходит в результате окисления гематоксилина путем отдачи 2 атомов водорода. Прибавляя к растворам сильные окислители (йодноватистый калий, перманганат калия, перекись водорода), можно этот процесс значительно ускорить. Без добавления окислителей приготовленные растворы гематоксилина должны “созревать” в течение 3-4 недель с доступом яркого света и кислорода воздуха, для чего раствор с красителем оставляют на подоконнике, накрыв марлей. При использовании искусственного (ускоренного) созревания необходимо учитывать, что с увеличением количества окислителя понижается устойчивость раствора гематоксилина при длительном хранении, а при переокислении образуются высшие степени окисления, так называемые оксигематеины, которые, наконец, переходят в грязно-коричневые малоценные продукты, не обладающие красящими свойствами [7].

Механизм окрашивания биологических тканей.

Гематоксилин представляет собой краситель, имеющий слабый отрицательный заряд. При переходе в продукты окисления, гематеин и оксигематеин, отрицательный заряд возрастает. При образовании лака под влиянием таких электролитов, как железные или калийные квасцы, происходит сильная положительная перезарядка красителя. Железные и квасцовые лаки, имеющие сильный положительный заряд, красят прогрессивно. Окраска фиксированных гистологических препаратов как основными, так и кислотными красителями представляет собой процесс адсорбции, тесно связанный с электрическим зарядом ткани [7].

По Унна (1928), всякая окраска начинается как физический процесс, при котором находящийся в растворе краситель проникает в более грубые и более тонкие тканевые поры, где распределяется и накапливается по физическим законам (капиллярность, поверхностное натяжение). Эта фаза продолжается в течение нескольких минут. Вторая фаза собственно окраски представляет собой  чисто химический процесс. При этом химически различные структуры преодолевают противодействующее акту окраски стремление к растворению со стороны той жидкой среды, в которой был растворен краситель. На третьей стадии, во время дифференцировки, можно с помощью более сильного растворителя модифицировать и ограничить получившиеся вначале химические соединения. Готовый препарат представляет собой новый химический индивидуум, в котором определенные сродства отдельных структур элементов связаны химически [7].

Лили Р. (1969) [5] общие методы окрашивания клеточных ядер разделяет на две основные группы: 1) методы, основанные на использовании основных (“катионных”) красителей с образованием соединений типа солей (в присутствии ДНК и РНК); 2) методы, основанные на последовательном или одновременном использовании двух- или трехвалентных ионов металлов (в качестве протравы) и красителя (чаще о-дифенолы), способного образовывать хелатный комплекс с ионом металла, который в свою очередь связывается в ткани с компонентами, обязательно кислыми по природе. Методы второй группы чаще применяют в тех случаях, когда нужно выявить ядра в материале, из которого были удалены нуклеиновые кислоты с помощью кислотной экстракции (в декальцинированной ткани). Поэтому такие протравные красители, особенно алюминиевые “лаки” (хелатные комплексы) гематоксилина, шире используются в общей гистологии, чем основные анилиновые красители.

Гематоксилин относят к группе протравных красителей. Он содержит две о-дифенильные группы. Гематоксилин в виде алюминиевых лаков широко используется для окрашивания ядер, нейтральных и кислых муцинов, а с Fe в степени окисления 3+ применяется в методах с последовательной протравой, с прогрессивной дифференцировкой лаков и в протравных прогрессивных красителях. Вместе с гематоксилином используют растворы фосфорновольфрамовой, фосфорномолибденовой и молибденовой кислот.

Обычно считают, что гематоксилин не окрашивает в отсутствие металлических протрав. Однако было показано, что гематоксилин медленно реагирует в отсутствии протрав с трихогиалином, кератогиалином, гранулами эозинофильных лейкоцитов, с некоторыми эластическими мембранами, образуя глубоко окрашенные комплексы. Комплексное соединение гематеина с металлом, называемое лаком, приобретает свойства основного красителя и способность взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот и другими компонентами клетки и межклеточного вещества. Цвет окрашенных структур зависит от солей металлов, выбранных в качестве протравы при различных методиках окраски.

Стандартные прописи и их применение. Особенности приготовления стандартных растворов

Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, хотя суть всех этих методов заключается в одном – его окислении.

Методы с железным гематоксилином

Существуют два метода окрашивания железным гематоксилином - регрессивный и прогрессивный. Первый основан на избыточном окрашивании и последующей дифференцировке путем отмывания в соответствующей жидкости; при этом соли железа вводят в раствор красителя либо обрабатывают ими срезы перед окрашиванием. Жидкость, служащая для дифференцировки, после окончания процедуры должна быть тщательно отмыта. Если она не отмыта, то продолжает действовать после достижения желательной степени дифференцировки и может испортить окраску [5, 7].

В прогрессивном методе используют кислые растворы или избыток солей железа, что позволяет избежать переокрашивания.

При регрессивной окраске рекомендуется употребление разведенных растворов, так как после применения очень концентрированных растворов последующая экстракция часто приводит к неравномерной пятнистой окраске. Так же и дифференцировка при применении разведенных растворов проходит равномернее. Толстые срезы для регрессивной окраски менее пригодны, чем тонкие, так как часто окрашиваются неравномерно [7].

Методы последовательной обработки основаны на предварительном протравливании водными растворами солей трехвалентного железа, окрашивании водными растворами гематоксилина до полного почернения среза и последующей дифференцировке кислотой или солями трехватентного железа под контролем микроскопа.

При кратковременном протравливании и применении свежеприготовленных растворов гематоксилина развивается синевато-черная окраска, а при более продолжительном протравливании в сочетании с выдержанными растворами гематоксилина дает черное или коричнево-черное окрашивание.

Железный гематоксилин Брусси [2]. Избирательно окрашивает ядра. Применяется для окрашивания тканевых культур.

Раствор А: 8 г железноаммиачных квасов растворяют в 100 мл теплой дистиллированной воды.

Раствор Б: 1 г гематоксилина растворяют в 100 мл теплой дистиллированной воды и охлаждают. Затем раствор А, постоянно взбалтывая, приливают к раствору Б. Смесь кипятят в течение приблизительно 1 минуты, быстро охлаждают и прибавляют 1%- раствор ледяной уксусной кислоты. Раствор годен к применению в течение 1-2 месяцев. Время окрашивания 0,5-1 минута, затем промывка водопроводной водой.

Результат: ядро окрашивается в синевато-черный цвет.

Железный гематоксилин Вейгерта [2, 5, 7, 8, 9]. Составляют по мере надобности из двух основных растворов. Основными являются раствор Вейгерта I и раствор Вейгерта II. Первый представляет собой 1%-раствор гематоксилина в 96%-спирте (1г гематоксилина + 100 мл 96%-спирта). Второй раствор имеет следующий состав: 4 мл раствора полуторахлористого железа (FeCl3), 1 мл концентрированной соляной кислоты, 95 мл дистиллированной воды. Перед применением смешивают оба раствора точно в равных объемах. Время окрашивания 1-2 минуты, затем промывка водопроводной водой. За указанное время срезы окрашиваются прогрессивно. Для дифференцировки применяется 0,1%-раствор солянокислого спирта, затем тщательная промывка водопроводной водой. Оба основных раствора могут сохраняться длительное время. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней.

Железный гематоксилин по Гейденгайну [2, 7, 8, 10]. При этом методе ткани сначала протравляют в растворе железных квасцов. В зависимости от свойств тканей они воспринимают квасцы с различной интенсивностью. При последующем действии гематоксилинового  раствора образуется черный железно-гематеиновый лак, который при следующей за этим экстракцией в разной степени удерживается отдельными элементами тканей.

Готовят два раствора.

А. Протрава: готовят 3%-водный раствор железных квасцов (синонимы: железноаммиачные квасцы, сернокислый окисно-железный аммиак, ферриаммиачный сульфат). Пригодны только светло-фиолетовые кристаллы; разложившиеся буровато-желтые крошащиеся кристаллы употреблять не стоит. Кристаллы, покрытые буровато-желтым порошком, следует обмыть дистиллированной водой.

Б. Краситель: 0,5 г гематоксилина растворяют в 10мл 96%-спирта и разбавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор должен созревать в течение 4-5 недель при доступе воздуха. Перед употреблением его разбавляют равным количеством дистиллированной воды. После окраски раствор профильтровывают и повторно употребляют; со временем его красящие качества улучшаются.

Можно пользоваться свежеприготовленным раствором. Тогда краситель дает голубовато-серые оттенки. Чем раствор старее, тем более темные тона он дает, и препарат медленнее дифференцируется. Наконец, наиболее старые и окисленные растворы вызывают рыжий тон окраски и практически становятся непригодными.

Если в запасе нет зрелого раствора, можно с помощью NaJO3 вызвать искусственное созревание (на 0,5 г гематоксилина точно 0,1 г NaJO3).

Можно использовать следующий способ быстрого получения “созревшего” раствора гематоксилина; при кипячении растворяют 1 г гематоксилина в 95 мл дистиллированной воды, после чего добавляют 5 мл карболовой кислоты.

Для тех же целей Г.В.Эпштейн рекомендует к каждым 100 мл свежеприготовленного красителя прибавлять 1 каплю 2,5%-раствора квасцов. Раствор долго сохраняет свои красящие свойства. При появлении осадка жидкость следует фильтровать[8].

Окрашивание препаратов методом Гейденгайна.

Процесс протравления и окраски можно ускорить (1-2 часа), если проводить его в термостате при температуре 45-50?С.

В результате зерна хроматина, ядрышки, различные гранулы, центросомы, фибриллы окрашиваются в черный цвет. Так как раскрашивание различных элементов идет с различной скоростью, возможно по желанию исследователя выявить нужные структуры. Скорость раскрашивания в значительной мере обусловливается толщиной срезов, характером фиксации, физико-химическими свойствами клеток и т.д.

Однако следует помнить, что самые разнородные элементы клеток и тканей при окраске гематоксилином могут окрашиваться одинаковым образом.

Существует способ быстрой окраски железным гематоксилином методом Гурвича А. Г. [1]. Срезы, освобожденные от парафина, доводят до воды, затем на предметное стекло наливают 3-4%-раствор железоаммиачных квасцов и нагревают над пламенем горелки до появления паров, споласкивают в дистиллированной воде, наливают на стекло раствор гематоксилина и подогревают до появления паров, споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 1,5-2% растворе железоаммиачных квасцов.

Бляхнер Л. Я. указывает, что этим методом можно получить такие же результаты, как и оригинальным [8].

Конкретное время протравливания окраски и дифференцировки зависит от многих факторов (качество реактивов, свойство исследуемого объекта, цели и задачи исследования и т.п.) и устанавливается опытным путем в каждом конкретном случае. Наиболее ответственным этапом окраски является дифференцировка, так как отдельные структурные компоненты клеток и тканей с различной скоростью отдают обратно накопленный краситель.

Быстрее всех обесцвечивается гомогенная часть цитоплазмы, затем ее гранулярные компоненты и в последнюю очередь структурные элементы ядра.

Железный гематоксилин по Ясвоину [8] . Этот способ отличается простотой и дает в течение нескольких минут элективную окраску ядер; рекомендуется для окраски клеток соединительной ткани.

Готовят 2 раствора.

А. 1г гематоксилина растворяют в 10 мл 96%-спирта, приливают 90 мл дистиллированной воды и оставляют до созревания (раствор должен приобрести красный цвет).

Б. Готовят 6%-раствор железоаммиачных квасцов.

Оба раствора смешивают в часовом стекле в таком соотношении, чтобы образующийся осадок выпал бы раньше, чем через 0,5 минуты, т.е. через срок, достаточный для окрашивания препарата. Если осадок выпадает через более длительный срок, то препарат будет окрашен недостаточно контрастно. Примерное соотношение: к 5 каплям квасцов прибавляют (встряхивая) 10-12 капель гематоксилина. Гематоксилин приливать к квасцам, а не наоборот. Приготовленный краситель на несколько секунд наливают на препарат и сразу же после образования осадка (краситель с препарата не сливать, иначе осадок плотно пристанет к срезам) препарат поливают большим количеством проточной воды, продолжая его промывать в течение 15-30 минут.

Недокрашенный препарат можно докрасить после 10-15-минутной промывки в дистиллированной воде, перекрашенный – можно дифференцировать 20%-железоаммиачными квасцами, а затем промыть и заключить в бальзам.

Железный гематоксилин по Рего [8]. Дает особенно хорошие результаты при изучении митохондрий.

Железный триоксигематеин по Ганзену [7, 8]. Дает стойкую ядерную окраску при умеренной подкраске цитоплазматических структур.

Приготовление растворов.

Раствор А. В 150 мл дистиллированной воды при легком нагревании растворяют 10 г фиолетовых кристаллов железных квасцов и 1,4 г сульфата аммония.

Раствор Б. 1,6 г гематоксилина растворяют при нагревании в 75 мл дистиллированной воды. После охлаждения обоих растворов раствор А при постоянном помешивании вливают в фарфоровую чашку, содержащую раствор Б (не наоборот). Смесь делается сначала коричневой, затем синей и, наконец, темно-фиолетовой. Смесь медленно нагревают до кипения и кипятят 30-60 секунд (не более), при этом лишь слегка помешивают, чтобы не слишком усилить окисление воздухом. Затем быстро охлаждают, пуская чашку плавать в холодной воде.

Готовый раствор должен иметь темно-коричневый цвет. Зеленоватый тон указывает не слишком сильное окисление. В этом случае раствор окрашивает хуже. Раствор, фильтруя, помещают в бутылку из иенского стекла и хорошо закрывают резиновой пробкой.

1.     Срезы поступают из дистиллированной воды в фильтрованный раствор красителя на 1-10 мин до достижения желательной степени окраски.

2.     Ополаскивание дистиллированной водой.

3.     15-30-минутная промывка в проточной воде.

4.     Споласкивание дистиллированной водой, спиртовый ряд, ксилол, бальзам.

Результат: черно-коричневая четкая окраска ядер. В зависимости от срока окраски и дифференцировки (в 2-3%-серной кислоте или 0,5-1%-уксусной кислоте) можно выявить также и самые различные клеточные структуры (зернистость, склеивающие полоски, реснички, волокнистые структуры и т.д.).

Если требуется подавить подкраску цитоплазмы и получить чистую ядерную окраску, то к 8 мл раствора красителя прибавляют 2-4 мл 1%-серной кислоты.

Окраска хлористожелезным гематоксилином по Геквисту [7].

Прогрессивный метод:

1.Срезы из воды поместить на 5 мин в 3-5%-раствор хлористого железа.

2. Ополоснуть дистиллированной водой.

3. Окрасить в 1%-растворе гематоксилина до прокраски желательных структур (обычно 3-5 мин).

4. Основательная промывка в проточной воде и т.д.

Регрессивный метод:

1.     Поместить в 5%-раствор хлористого железа на 1 час.

2.     Сполоснуть в дистиллированной воде.

3.     Окрасить в 1%-растворе гематоксилина 1 час.

4.     Сполоснуть дистиллированной водой.

5.     Дифференцировать в 1%-растворе хлористого железа.

6.     Промывка и т.д.

Этот метод не дает избирательной ядерной окраски, а подкрашивает многие другие структуры. Геквист особенно рекомендует его после фиксации в сулеме, формалине и т.п., кроме того, после жидкости Карнуа и трихлоруксусной кислоты. Фиксация чистым формалином менее пригодна. Свежеприготовленный раствор гематоксилина окрашивает в синий, старый – в черно-коричневые тона.

Методы с квасцовыми гематоксилинами [5].

Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо-аммониевые квасцы. Такие комплексы обычно называются квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Так как красящим началом является гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им “вызреть”. Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3-4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.

Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще в кислых растворах.

Кислый гемалаун Майера[1, 7]. Может быть использован сразу после приготовления, дает чистую интенсивно синюю окраску ядер.

1г гематоксилина растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,2 г иодноватистого натрия (NaJO3) и 50 г химически чистых калийных квасцов. Обе соли растворяют при многократном помешивании; при этом раствор принимает фиолетово-синюю окраску. Затем добавляют к раствору 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты, после чего раствор становится фиолетово-красным. Красящий раствор при хранении в хорошо закрытом сосуде из иенского стекла может долго оставаться годным для применения.

1.   Срезы из дистиллированной воды поместить на 4-6 мин в краску до прокрашивания ядер (контролировать под микроскопом).

2.   Минимум 10 мин промывать в часто сменяемой или проточной обычной воде, после этого темно-синий тон проявляется с полной интенсивностью.

Результаты: ядра ярко-синие, хрящ темно-синий, остальные ткани или не окрашены, или слабо серо-синие.

После кислого гемалауна тщательно промывать препараты, так как неудаленные остатки кислоты вредны для окраски.

Двойная окраска гемалаун-эозином [7]. Часто ядерную окраску гемалауном соединяют с дополнительной окраской (окраска цитоплазмы) эозином или эритрозином (обычно в 0,1%-водном растворе). Для проведения окраски препараты, окрашенные кислым гемалауном, основательно промывают и помещают на 3-5 мин или больше в раствор красителя. Продолжительность окраски зависит, помимо концентрации раствора красителя, от лучшей или худшей окрашиваемости препарата; последняя, в свою очередь, обусловливается характером фиксации. Так как часть краски при последующей обработке снова вытягивается (в воде и слабых спиртах больше, чем в сильных), то окрашивать нужно сильнее, чем должен быть окончательный тон. Если срезы достаточно сильно окрашены, то избыток красителя отмывают в воде; затем ряд спиртов, ксилол, бальзам.

Результат: ядра и хрящ синие, все остальное окрашено в различные градации красного тона. Эритроциты после фиксации в жидкости Ценкера и др. оранжево-красные.

Следует учитывать, что при слишком густой окраске препарат становится грязным и нечетким. Таким образом, следует избегать слишком сильной окраски и устранять избыток красителя посредством достаточно длительного извлечения его водой или 70%-спиртом. При дифференцировке составные части тканей отдают эозин с различной скоростью. Дольше всего удерживают краситель эозинофильные гранулы, желточные пластинки, ядрышки и эритроциты.

Если кислотный краситель, используемый для дополнительной окраски (эозин), воспринимается плохо, то раствор красителя подкисляют слабой уксусной кислотой (не более 1 капли на 100 мл раствора), так как более сильное подкисление может ослабить окраску гематоксилином. Слабое же подкисление не вредит.

Квасцовый гематоксилин но Эрлиху [1, 7, 8, 9]. 2г гематоксилина растворяют в 100 мл 96%-спирта и добавляют 100 мл воды, 100 мл химически чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 мл уксусной кислоты.

Краситель должен “созревать” примерно 14 дней. Раствор сохраняет красящую силу долгое время. Если вместо гематоксилина взять 0,25-0,5 г гематеина, то краситель пригоден к употреблению тотчас же после изготовления. Окрашивание производят так же, как и гематоксилином Майера. После окрашивания хорошо промывают проточной водой – срезы должны интенсивно посинеть. Ядра окрашиваются в темно-синий цвет.

Окраска гематоксилином Делафильда [2, 7, 8, 9]. В 25 мл абсолютного спирта растворяют 4 г гематоксилина и прибавляют этот раствор к 400 мл насыщенного водного раствора аммиачных квасцов (40 г аммиачных квасцов на 400 мл дистиллированной воды). Через 3-4 дня, в течение которых жидкость оставляют открытой на свету, ее фильтруют и вливают по 100 мл глицерина и метилового спирта. Через несколько дней жидкость снова фильтруют. Этот запасной раствор сохраняется хорошо. Окрашивают обычно 4-24 часа в сильно разведенном растворе (при 4 – 5-часовой окраске берут 0,5 мл на 50 мл дистиллированной воды). Затем промывка в простой воде.

В результате элективно окрашиваются ядра в синий цвет, волютин (у простейших)  - в красно-буро-фиолетовый.

Окраска квасцовым гематоксилином по Ганзену [7]. Вследствие малого содержания квасцов в нем, кроме ядер, окрашиваются в серо-синий тон и другие части препарата несколько сильнее, чем в гемалауне. Поэтому при известных условиях от дополнительной окраски можно отказаться.

Раствор А. 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта.

Раствор Б. 20 г калийных квасцов растворяют в 200 мл теплой дистиллированной воды; после охлаждения фильтруют.

Раствор В. 1 г марганцевокислого калия растворяют в 16 мл дистиллированной воды.

На следующий день смешивают в фарфоровой чашке при помешивании растворы А и Б, медленно прибавляют точно 3 мл раствора В (отмерив измерительной пипеткой) и подогревают при постоянном помешивании до кипения.

30-60 секунд оставляют кипеть, быстро остужают и фильтруют.

Благодаря прибавлению марганцевокислого калия гематоксилин окисляется в гематеин. 1 г гематоксилина требует точно 0,177 г марганцевокислого калия.

Квасцовый гематоксилин по Карацци [8, 9]. Гематоксилина – 0,5 г, калийных квасцов – 25 г, иодноватокислого калия (KJO3)  - 0,01 г, глицерина – 100 мл, дистиллированной  воды – 400 мл.

Гематоксилин дает очень интенсивное окрашивание ядер на срезах. Способ окрашивания тот же, что и гематоксилином Майера. Обычно красят прогрессивно, но можно также перекрашивать и дифференцировать подкисленным спиртов.

Квасцовый гематоксилин по Бемеру [1, 8, 9]. 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта и вливают в 200 мл 10%-раствора калийных квасцов (квасцы растворяют при нагревании, охлаждают и фильтруют). Краситель оставляют на 4-5 недель на свету в широкогорлой открытой банке для “созревания”.

Окрашивание производят в течение 3-5 минут, в зависимости от зрелости гематоксилина. Промывают водопроводной водой, в которую можно прибавить несколько капель нашатырного спирта. Через несколько минут окраска среза из красно-фиолетовой станет интенсивно-синей. В результате ядра будут окрашены в синий цвет. Можно дифференцировать соляной кислотой.

Методика окраски срезов с дифференцировкой [6, 9].

1.     Срезы перекрашивают в свежепрофильтрованном гематоксилине (Бемера, Делафильда, Эрлиха) в течение 3-20 минут в зависимости от степени зрелости красителя и его красящей силы.

2.     Промывают в водопроводной воде 2-3 минуты и более.

3.     Переносят в чашечку с солянокислым спиртом (0,5-1% HCl на 70% спирте) и дифференцируют в нем от 3-5 до 30 секунд и более, смотря по степени закрашивания. Срез во время дифференцировки краснеет. Излишне длительная задержка срезов в солянокислом спирте ведет к полному извлечению краски.

4.     Перекладывают в большую чашку с водопроводной водой с целью нейтрализовать кислоту и подсинить ядра, ставшие красноватыми после кислоты, что достигается в щелочной среде. Так как водопроводная вода обладает слабощелочной реакцией, посинения ядер можно добиться, оставляя срезы в воде на продолжительное время (на 15-20 минут и больше). В теплой водопроводной воде срезы синеют быстрее.

Если желают получить резко синие ядра, промывную воду со срезами искусственно подщелачивают нашатырным спиртом (3-5 капель нашатырного спирта на 0,5 л водопроводной воды.

         В искусственно подщелоченной воде срезы синеют очень быстро, после чего их переносят в другую чашку со свежей водопроводной водой для отмывания от щелочи на 30 мин и дольше (до 24 часов). Тщательное отмывание необходимо, иначе срез плохо воспримет эозин.

Подсиненные и тщательно отмытые срезы в дальнейшем обрабатывают в обычном порядке, т.е. извлекают из чистой промывной воды, докрашивают эозином, споласкивают в воде, обезвоживают, просветляют, заключают в бальзам.

При такой окраске с дифференцировкой препараты получаются более контрастными и яркими, синие и темные ядра резко выделяются на чистом розовом фоне.

Методика окраски гематоксилин-эозином на предметном стекле [6].

1.     Срезы переносят в чашку с водой.

2.     Извлекают на предметное стекло в расправленном виде.

3.     Производят депарафинизацию среза.

4.     Опускают срез в раствор профильтрованного квасцового гематоксилина. Окрашивают 0,5-5 минут, в зависимости от зрелости гематоксилина.

5.     Препарат опускают в большую чашку с водой.

6.     Промывают в воде 3-10 минут, ожидая посинения среза. Только что окрашенные гематоксилином срезы имеют красновато-фиолетовый тон, который при промывании в подщелоченной воде переходит в синий. Синие ядра клеток будут более контрастными при сочетании с эозином.

7.     Хорошо промытый и посиневший срез извлекают из воды и опускают в раствор эозина. Окрашивают в течение 0,5-1-2-3 минут, в зависимости от красящей способности того или иного эозина.

8.     Далее промывают в большой чашке с водопроводной водой 0,5-1 минуту.

9.     Мягкой тряпочкой удаляют вокруг среза воду и осторожно опускают в 96% спирт. Выдерживают в спирте от 0,5 до 3-5 минут, так как помимо обезвоживающего, он имеет и дифференцирующее действие в отношение эозина. Спирт лучше применять повторно, меняя 2-3 раза.

10.                       Извлекают препарат из спирта, быстро удаляют остатки его вокруг среза и, не давая ему подсохнуть, опускают в просветляющее вещество (креозот, эфирное масло, карбол-ксилол, скипидар и пр.). Выдерживают примерно 1-3 минуты.

11.                       Быстро (0,5-1 мин) промывают ксилолом.

12.                       Удаляют остатки ксилола вокруг среза, кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.

Методика проведения окраски парафиновых срезов гематоксилин-эозином по методу Бемера.

1.     Наклейка парафиновых срезов на стекла:

2.     Обработка стекол смесью белок-глицерин с тимолом.

3.     После наклейки среза:

i.      96% спирт – 5 минут

ii.      70% спирт – 2-3 минуты

iii.      дистиллированная вода – 2-3 минуты

4.     Подготовка срезов к окраске:

i.      3 порции ксилола – по 4-5 минут

ii.      100% спирт – 2-3 минуты

iii.      96% спирт – 2-3 минуты

iv.      70% спирт – 2-3 минуты

v.      дистиллированная вода – 1-2 минуты

5.     Окраска:

i.      Гематоксилин Бемера – 3-5 минут

b.     Дистиллированная вода, подкисленная HCl – 5-30 с

6.     Дистиллированная вода, подщелоченная  - 30 с

i.      Дистиллированная вода – 3-5 минут

ii.      Раствор эозина – 1-2 минуты

iii.      Дистиллированная вода – 1 минута

7.     Обезвоживание и дифференцировка:

i.      70% спирт – 1 минута

ii.      80% спирт – 1 минута

iii.      96% спирт – 1 минута

iv.      100% спирт – 1 минута

v.      ксилол I – 2-3 минуты

vi.      ксилол II – 2-3 минуты

8.     Заключение срезов в бальзам.

Перспектива применения метода окраски гематоксилин-эозином

В течение некоторого периода применения гематоксилина в микроскопической технике были предприняты попытки отыскать ему более дешевую и удобную замену. Было предложено использовать такие природные красители, как сок черники, черной смородины [6]. Также синтетические красители (антоциан ВВ, феноцианин ТС, галлеин, бразилин, ализариновый синий S, целестиновый синий). Однако ни один из данных заменителей в настоящее время не применяется так широко, как гематоксилин.

В статье Шорманова С. В.и Яльцева А. В. “Применение электромагнитного поля в приготовлении квасцового гематоксилина”[13] говорится об использовании стимулирующего эффекта электромагнитного поля для сокращения сроков созревания квасцового гематоксилина Эрлиха. Так как традиционный способ приготовления гематоксилина Эрлиха требует больших затрат времени в процессе “созревания”, предлагается способ, позволяющий значительно ускорить данный процесс.

Сущность метода заключается в том, что сосуд со свежеприготовленным раствором красителя объемом 150 мл помещают на катушку электромагнита, на которую подают постоянный электрический ток напряжением 100 В и силой тока 10 А. При этом сосуд с красителем находится в электромагнитном поле с индукцией 0,0138 Тл, пока раствор не окрасится в темно-вишневый цвет. В результате время на приготовление раствора сокращается до 10-12 часов. Краситель приобретает те же красящие свойства, что  и при приготовлении его обычным традиционным методом.

Огромное внимание многих авторов к данному методу окраски гистологических препаратов и новейших тенденциях по разработке современных методов говорит об уникальности и незаменимости его свойств в научных исследованиях и лабораторной диагностике.

ЛИТЕРАТУРА

1.     Волкова О.В. и Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. – М.: Медицина, 1971.

2.     Кисели Дьердь. Практическая микротехника и гистохимия. - Будапешт: Изд. академии наук Венгрии, 1962. - С.111–113.

3.    Коржевский Д. Э. Применение гематоксилина в гистологической технике. – Морфология. – 2007. – Т. 132. - №6. - С. 77 – 81.

4.    Лавдовский М. Д. Основания к изучению микроскопической анатомии человека и животных. - СПб, 1887, 1888.

5.    Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. – М.: Мир, 1969. - С. 102 – 108, 157 – 167.

6.    Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С. 156 – 165, 171 – 172.

7.    Ромейс Б. Микроскопическая техника. – М.: Издательство иностранной литературы, 1954. - С. 143 – 152, 156 – 164.

8.    Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б. Микроскопическая техника. – М.: Советская наука, 1957. - С. 189–195, 301 – 304.

9.    Сапожников А. Г., Доросевич А. Е. Гистологическая и микроскопическая техника. – Смоленск: САУ, 2000. - С. 137 – 147.

10.  Саркисов Д. С. и Перов Ю.Л. Микроскопическая техника (руководство для врачей и лаборантов).- М.: Медицина, 1996.

11.  Соболев Л. В. Основы патолого–гистологической техники. – СПб. :В. Безобразовъ и Ко, 1910.

12.  Фрайштат Д. М. Реактивы и препараты для микроскопии. Справоч-ник. – М.,1980.

13.  Шорманов С. В.Применение электромагнитного поля в приготовлении квасцового гематоксилина. – Морфология.–1998.-№6. -  С.73-74.

Application of haematoxylin in microscopic techniques

Gorbunova T. K.

         In the article a variety of methods of haematoxylin staining are analysed. The most popular techniques of preparation of haematoxylin stuff and mechanisms of staining biological tissues as well are observed.

         Key words: haematoxylin, histological techniques, staining methods.

Кафедра анатомии человека

Смоленская государственная медицинская академия