1. ТИПЫ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК
Первичной культурой называют культуру клеток на стадии непосредственно после выделения клеток и до первого посева. Рассмотрим 4 стадии:
1) получение образца;
2) выделение ткани;
3) препарирование и/или дезагрегация и
4) культура после посева в культуральный сосуд.
После выделения первичная культура клеток может быть получена как путем миграции клеток из фрагмента ткани и прикрепления их к подходящему субстрату, так и при дезагрегации ткани (механическим путем или с помощью ферментов) для получения суспензии клеток, некоторые из которых, в конечном итоге, прикрепятся к субстрату. Для большинства нормальных трансформированных клеток, за исключением гематопоэтических, необходимо прикрепление к плоской поверхности для выживания и максимально эффективной пролиферации. Трансформированные клетки, в особенности индивидуальные клетки из трансплантируемых опухолей животных, напротив, часто способны пролиферировать в суспензии.
К ферментам, которые наиболее часто используют для дезагрегации ткани, относятся неочищенные препараты трипсина, коллагеназа, эластаза, проназа, диспаза, ДНКаза и гиалуронидаза, которые используют либо по отдельности, либо в различных комбинациях, например эластазу с ДНКазой для выделения альвеолярных клеток II типа [Dobbs & Gonzalez, 2002], коллагеназу вместе с диспазой [Booth & O’Shea, 2002] и коллагеназу вместе с гиалуронидазой [Berry & Friend, 1969; Seglen, 1975]. Другие ферменты, не животного происхождения, такие как Trypzean (Sigma) — рекомбинантный кукурузный трипсин, TrypLE (Invitrogen) — рекомбинантный трипсин, продуцируемый микробами и Ас-cutase и Accumax (Innovative Cell Technologies), также подходят для первичной дезагрегации. Препараты грубой очистки часто более эффективны, чем очищенные ферментные препараты, так как первые содержат примеси других протеаз, хотя последние обычно менее токсичны и их действие более специфично. Трипсин и проназа дают более полную дезагрегацию, но могут повреждать клетки. С другой стороны, коллагеназа и диспаза дезагрегируют клетки неполностью, но менее токсичны. Гиалуронидаза используется в сочетании с коллагеназой для разрушения внутриклеточного матрикса, а ДНКаза используется для уничтожения ДНК, высвободившейся из лизированных клеток; ДНК снижает эффективность протеолиза и содействует реагрегации клеток.
Хотя для обработки каждой ткани может потребоваться своя последовательность действий, для большинства имеются некоторые общие требования:
1)Жир и некротические ткани лучше всего удалять во время препарирования.
2)Ткань следует мелко нарезать острым инструментом для того, чтобы повреждения были минимальными.
3)Использованные для дезагрегации ферменты должны быть впоследствии удалены с помощью мягкого центрифугирования.
4)Концентрация клеток в первичной культуре должна быть намного выше, чем обычно используемая при субкультивировании, так как процент клеток, которые выживут в первичной культуре, может быть довольно низким.
5)Предпочтительней использовать богатые среды, такие как среда Хэма F12, а не простые, такие как МЕМ Игла. Если требуется сыворотка, следует учесть, что фетальная бычья сыворотка способствует лучшей выживаемости по сравнению с телячьей или лошадиной. Для выделения специфических типов клеток, вероятно, потребуются селективные среды.
6)Дезагрегация эмбриональных тканей проходит легче, чем тканей взрослого организма, выживает больше клеток, и они быстрее начинают пролиферировать.
2. ВЫДЕЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ТКАНИ
Перед началом работы с тканями животных или человека вы должны быть уверены, что ваша работа соответствует требованиям медицинской этики или современным законодательным нормам в отношении экспериментов с животными. Например, в Великобритании использование эмбрионов или плодов после середины срока беременности регулируется законом об экспериментах на животных 1986 года
(Animal Experiments (Scientific Procedures) Act of 1986).
Для работы с биопсийным или фетальным материалом человека обычно требуется согласие местного комитета по этике и пациента и/или его или ее родственников.
Требование безопасности. Работа с тканями человека должна выполняться в соответствии с Уровнем защиты 2 в ламинарных шкафах II класса биологической защиты.
Необходимо попытаться простерилизовать место резекции 70%-м спиртом (в случае если есть вероятность загрязнения, например на коже). Асептически вырежьте ткань и как можно скорее перенесите ее в лабораторию культуры ткани в BSS (DBSS) или в среде для транспортировки. Не препарируйте животных в лаборатории культуры тканей, так как животные могут внести бактериальную контаминацию. Если задержка в транспортировке ткани неизбежна, ткань можно хранить при 4 °С до 72 ч, хотя лучший результат достигается при быстрой транспортировке.
2.1. Мышиный эмбрион
Эмбрионы мыши — это удобный источник клеток для получения недифференцированных фибробластоидных культур. Их часто используют в качестве фидерного слоя.
2.2.Куриный эмбрион
Куриные эмбрионы проще препарировать, так как они больше мышиных эмбрионов на аналогичной стадии развития. Так же как и мышиные эмбрионы, куриные эмбрионы используются для получения первичной культуры мезенхимальных клеток для исследования клеточной пролиферации, для получения клеток для фидерного слоя и как субстрат для наращивания вируса. Из-за крупного размера у куриных эмбрионов легче
изолировать индивидуальные органы для получения специфичных типов клеток, таких как гепатоциты, кардиомиоциты и легочный эпителий. Как и в случае с мышиными эмбрионами, эксперименты с куриными эмбрионами подпадают под действие закона об экспериментах на животных (например, в Великобритании), поэтому для работы с эмбрионами после половины срока беременности может потребоваться лицензия.
2.3. Биопсийный материал человека
При использовании биопсийного материала человека возникают определенные проблемы, с которыми не сталкиваются при работе с тканями животных. Обычно необходимо получить согласие 1) комитета по этике больницы, 2) лечащего врача или хирурга и 3) донора или больного или родственников больного. Кроме того, образцы биопсии обычно берут для диагностических целей, и, следовательно, в первую очередь учитываются интересы патологоанатома . Значение этого фактора снижается в случае обширной хирургической резекции или при заборе непатологических тканей (например, плаценты или пуповины).
Операции часто выполняются постоянными сотрудниками больницы во время, не всегда подходящее для лаборатории культуры тканей, таким образом, должна быть предусмотрена система временного хранения на тот период, когда вы или кто-либо из ваших сотрудников не сможет находиться в лаборатории.
Если налажена доставка материала в вашу лабораторию, то должна быть организована система получения образцов, записи подробностей об источнике, ткани, патологии и т.д. и оповещения сотрудника, который будет заниматься культивированием, о прибытии образца; в противном случае ценный материал может быть потерян или испорчен.
Требование безопасности.
При работе с биопсийным материалом человека существует опасность инфекционного заражения сотрудников, поэтому работать с ним необходимо в соответствии с Уровнем защиты 2 в ламинарных шкафах II класса биологической защиты. Все материалы и инструменты после использования должны быть продезинфицированы автоклавированием или погружением в соответствующий дезинфектант. Ткани должны быть протестированы на наличие случайных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и если только больного уже не проверяли на эти инфекции.
3. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Разработано несколько методик для дезагрегации ткани при получении первичной культуры. Эти методики можно подразделить на 1) простые механические методы, включающие рассечение с некоторыми видами размягчения или без, и 2) методы с использованием ферментативной дезагрегации. Первичные эксплантаты применяются, когда доступны лишь очень малые количества ткани; энзиматическая дезагрегация является предпочтительной, когда имеются в наличии большие объемы ткани. Механическую дезагрегацию хорошо использовать, размельчая мягкие и некоторые плотные ткани, когда количество жизнеспособных клеток на выходе не является существенным.
3.1. Первичный эксплантат
Метод первичного эксплантата, разработанный Harrison [1907], Carrel [1912] и другими учеными, был первым методом получения культуры ткани. В оригинальном варианте фрагмент ткани погружали в плазму крови или лимфу, смешивали с гетерологичной сывороткой и эмбриональным экстрактом и помещали на покровное стекло, переворачивали и заключали в часовое стекло.
Комок плазмы удерживал ткань на месте, и эксплантат можно было рассматривать с помощью обычного микроскопа. Гетерологичная сыворотка индуцировала сворачивание плазмы, эмбриональный экстракт, сыворотка и плазма снабжали клетки питательными веществами и факторами роста и стимулировали миграцию клеток из эксплантата. Эта методика используется до сих пор, но, по большей части, заменена упрощенным методом, описанным в протоколе.
Этот метод особенно полезен при работе с небольшими количествами ткани, например при биопсии кожи, когда есть риск потери клеток в ходе механической или ферментативной дезагрегации. Недостатки его заключаются в низкой адгезивности некоторых тканей и селекции клеток в процессе роста. На практике, однако, большинство клеток, особенно эмбриональных, успешно мигрируют.
Прикрепление эксплантатов.
Как прикрепление, так и миграцию клеток можно простимулировать, поместив на поверхность эксплантата стеклянное покровное стекло или поцарапать эксплантат пластиковой чашкой Петри перед прикреплением ткани к поверхности флакона [Elliget & Lechner, 1992] Прикрепление также можно стимулировать или улучшить, обработав пластик полилизином или фибронектином или сформировав фидерный слой. Исторически сложилось, что для улучшения прикрепления использовали сгустки плазмы. Поместите каплю плазмы на пластиковую поверхность и заключите в ней эксплантат. Это должно индуцировать сворачивание плазмы в течение нескольких минут, после чего можно добавить среду. В качестве альтернативы можно использовать очищенный фибриноген и тромбин [Nicosia & Ottinetti, 1990].
3.2. Ферментативная дезагрегация
Межклеточная адгезия в тканях опосредуется различными гомотипически взаимодействующими гликопептидами (молекулы клеточной адгезии, или САМ), некоторые из которых кальций-зависимые (кадгерины) и, следовательно, чувствительны к хелатирующим агентам, таким как ЭДТА или ЭГТА.
Интегрины, которые связываются с аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) мотивом внеклеточного матрикса, также имеют Са2+-связывающий домен, и удаление Са2+ на них тоже влияет. Межклеточный матрикс и базальные мембраны содержат другие гликопротеины, такие как фибронектин и ламинин, чувствительные к протеазам, и менее чувствительные протеогликаны, которые иногда поддаются протеолизу гликоназами, такими как гиалуронидаза или гепариназа. Простейший подход заключается в переходе от простого раствора для дезагрегации к более сложному. Вначале используется раствор трипсина или смеси трипсин/ ЭДТА, далее добавляют другие протеазы чтобы улучшить дезагрегацию и на следующей стадии, трипсин при необходимости удаляется, для того чтобы увеличить выживаемость клеток. Обычно повышение чистоты ферментов позволяет лучше контролировать процесс и, повышая специфичность, снижать токсичность, но может также приводить к ухудшению дезагрегации.
Механическая и ферментативная дезагрегации ткани позволяют избежать проблемы селекции клеток, возникающей при их миграции из эксплантата, и повышают выход большего количества клеток, которые отражают состав ткани за короткое время.
Однако, подобно тому как метод первичного эксплантата приводит к селекции клеток по их способности мигрировать из ткани, методы диссоциации приводят к селекции клеток по их устойчивости к протеазам и механическому стрессу.
Эмбриональные ткани лучше поддаются диспергированию и дают больший выход пролиферирующих клеток, чем ткани новорожденных или взрослых. На повышение сложности получения жизнеспособных пролиферирующих клеток с увеличением возраста донора влияют несколько факторов, среди которых возникновение дифференцировки, повышение содержания грубоволокнистой соединительной ткани и внеклеточного матрикса и снижение пула недифференцированных пролиферирующих клеток. Когда
для дезагрегации ткани требуются более жесткие процедуры (например, продолжительная трипсинизация или интенсивное перемешивание), наиболее нежные компоненты ткани могут разрушаться. Например, в фиброзных опухолях очень трудно добиться полной диссоциации клеток трипсином так, чтобы при этом еще и остались жизнеспособные клетки карциномы.
Выбор степени чистоты трипсина всегда труден, так как существуют две противоположные точки зрения:
1) более чистый трипсин менее токсичен, и результат его действия более предсказуем;
2) трипсин грубой очистки более эффективен, возможно, из-за присутствия в нем других протеаз.
На практике могут понадобиться предварительные эксперименты для определения оптимальной степени чистоты, необходимой для получения жизнеспособных клеток, так как трудно предсказать, какой будет баланс между чувствительностью клеток к токсическим эффектам и дезагрегационной активностью трипсина.
Чаще всего для дезагрегации тканей используется трипсин грубой очистки [Waymouth, 1974], так как он довольно хорошо переносится многими клетками и эффективен в отношении многих тканей. Остаточная протеазная активность, остающаяся после промывания, нейтрализуется сывороткой культуральной среды или, в случае использования бессывороточной среды, ингибитором трипсина (например, ингибитор
трипсина из сои).
ПРОТОКОЛ 12.4. Первичные эксплантаты
Схема
Ткань разрезают на кусочки, промывают, помещают на поверхность культурального флакона или чашки Петри в маленьком объеме среды с высокой концентрацией (а именно, 40-50%) сыворотки таким образом, чтобы поверхностное натяжение удерживало кусочки на месте, пока они не прикрепятся спонтанно к поверхности. После того как это будет достигнуто, обычно следует разрастание клеток.
Стерильные материалы
•Ростовая среда (например, 50:50 DMEM: F12 с 20% фетальной бычьей сыворотки.
•100 мл DBSS.
•Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры клеток.
•Пинцет.
•Скальпели.
•Пипетки на 10 мл с широким концом.
•Центрифужные пробирки на 15 или 20 мл или универсальные контейнеры.
•Культуральные флаконы на 25 см2 или чашки Петри для культуральных работ диаметром 5-6 см. Размер флаконов и объем ростовой среды зависит от количества ткани: на 10 мг ткани необходимо приблизительно пять флаконов на 25 см2.
Протокол
1.Перенесите ткань в свежий стерильный DBSS и промойте.
2.Перенесите ткань во вторую чашку, удалите нежелательные ткани, такие как жир или некротический материал, и перенесите в третью чашку.
3.Мелко нарежьте скрещенными скальпелями на кусочки размером около1 кубического миллиметра.
4.С помощью пипетки (10-20 мл с широким носиком) перенесите в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 или 50 мл или в универсальный контейнер. (Предварительно смочите пипетку изнутри BSS или средой, иначе кусочки ткани будут прилипать.)
5.Дайте кусочкам осесть.
6.Промойте путем ресуспендирования кусочки в DBSS, дайте кусочкам осесть и удалите супернатант. Повторите эту операцию не менее двух раз.
7.Перенесите кусочки (не забывая смачивать пипетку)в культуральный флакон, приблизительно 20-30 кусочков на флакон площадью 25 см2.
8.Удалите большую часть жидкости и добавить 1 мл ростовой среды на 25 см2 ростовой поверхности.
9.Закройте флакон и поместите его в инкубатор или термальную комнату на 37 °С на 18-24 ч.
10.Если кусочки прикрепились, далее объем среды можно постепенно увеличивать в течение следующих 3-5 дней до 5 мл на 25 см2 и затем менять среду еженедельно, пока не будет наблюдаться значительный рост клеток.
11.После достижения роста клеток оставшийся эксплантат может быть удален с помощью скальпеля и перенесен предварительно смоченной пипеткой в свежий культуральный сосуд. (И далее повторить начиная с этапа семь.)
12.Меняйте среду в первом флаконе до тех пор, пока растущие клетки не покроют, по крайней мере, 50% ростовой поверхности, после чего клетки можно пересевать.
============================================
3.3. Теплый трипсин
Для сохранения максимальной выживаемости клеток важно минимизировать время инкубации клеток в активном трипсине. Следовательно, при трипсинизации ткани при 37 °С, диссоциированные клетки необходимо собирать каждые полчаса, трипсин должен
быть удален центрифугированием и нейтрализован сывороткой среды.
Этот метод полезен для дезагрегации больших количеств ткани за относительно короткое время, особенно для целых мышиных или куриных эмбрионов. Метод плохо подходит для дезагрегации тканей взрослых организмов, которые содержат много фиброзной соединительной ткани, и некоторых чувствительных типов клеток, таких как эпителий, которые могут быть повреждены при механическом перемешивании. Если после центрифугирования и ресуспендирования будет наблюдаться реагрегация клеток, их необходимо проинкубировать в течение 10-20 мин с ДНКазой (10-20 мкг/мл) и повторно отцентрифугировать.
3.4.Трипсинизация с преинкубацией на холоду
Одним из недостатков использования трипсина для дезагрегации является повреждение тканей, которое может происходить вследствие продолжительной инкубации ткани при 37 °С. Поэтому после каждых 30 мин инкубации в теплом трипсине необходимо отбирать диссоциировавшиеся клетки, хотя для полной дезагрегации ткани требуется 3-4 ч. Более простым методом, который позволяет минимизировать повреждения клеток в течение инкубации, является погружение ткани в трипсин, охлажденный до 4 °С, и инкубация в течение 6-18 ч для более полного проникновения фермента в ткань. В этих условиях протеолитическая активность трипсина низка.
После этой процедуры требуется только 20-30 мин инкубировать ткань при 37 °С для дезагрегации [Cole & Paul, 1966].
Метод холодной трипсинизации обычно дает более высокий выход жизнеспособных клеток и повышает их выживаемость после 24 ч культивирования. Также сохраняется больше различных типов клеток, чем при теплойтрипсинизации. Культуры, полученные из мышиных эмбрионов, содержат больше эпителиальных клеток, будучи приготовлены с помощью холодной трипсинизации. Культуры эритроидных клеток, полученные из печени 13-дневных плодов мыши с помощью холодной трипсинизации, отвечают на эритропоэтин, чего не происходит с культурами, полученными с помощью теплой трипсинизации, или механической дезагрегации [Cole & Paul, 1966; Conkie, персональное сообщение]. Метод холодной трипсинизации также удобен тем, что не требуется ни перемешивания, ни центрифугирования и инкубацию при 4 °С можно проводить в течение ночи.
ПРОТОКОЛ 12.5. Дезагрегация ткани теплым трипсином
Схема
Ткань разрезают на кусочки и перемешивают в трипсине в течение нескольких часов. Диссоциированные клетки собирают каждые полчаса, центрифугируют и объединяют в среде, содержащей сыворотку.
Материалы
•Стерильные или приготовленные в асептических условиях:
•Ткань, 1-5 г
•DBSS, 50 мл (см. Приложение I)
•Трипсин (грубый), 2,5% в D-PBSA или физиологическом растворе
•D-PBSA, 200 мл
•Ростовая среда с сывороткой (например, DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки)
•Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры ткани
•Предварительно взвешенные флаконы
•Центрифужные пробирки на 50 мл или универсальные контейнеры, 2
•Флакон для трипсинизации: флакон Эрленмейера (предпочтительно с насечками или флакон с перемешиванием.
•Магнит для магнитной мешалки, автоклавированный в пробирке
•Изогнутый пинцет
•Пипетки (пастеровские на 2 и 10 мл)
Нестерильные
•Магнитная мешалка
•Гемоцитометр или счетчик клеток
Протокол
1.Перенесите ткань в чашки Петри диаметром 9 смсо свежим стерильным DBSS и промойте.
2.Перенесите ткань во вторую чашку; удалите нежелательные ткани, такие как жир или некротический материал и перенести в третью чашку.
3.Нарежьте скрещенными скальпелями на кусочки размером около 3 кубических миллиметров.
4.Перенесите ткань с помощью изогнутого пинцета в предварительно взвешенный флакон или пробирку.
5.Дайте кусочкам осесть.
6.Промойте путем ресуспендирования кусочки в DBSS, дайте кусочкам осесть и удалите супернатант. Повторите эту операцию не менее двух раз.
7.Слейте жидкость из флакона или пробирки и еще раз взвесьте.
8.Перенесите все кусочки в пустой флакон для трипсинизации, промытые DBSS флакон или пробирку.
9.Удалите большую часть оставшейся жидкости и добавьте 180 мл D-PBSA
10.Добавьте 20 мл 2,5% трипсина. (На этой стадии, если требуется, можно добавить другие ферменты, например коллагеназу, гилуаронидазу или ДНКазу.)
11.Поместите во флакон магнит для мешалки.
12.Закройте флакон и поставьте его на магнитную мешалку в инкубатор или в термальную комнату на 37 °С.
13.Перемешивайте на скорости 100об./мин при 37 °С.
14.После 30 мин инкубации соберите диссоциированные клетки следующим образом:
а)Дайте кусочкам осесть
б)Слейте супернатант в центрифужную пробирку и поместите его на лед.
в)Добавьте свежий трипсин к оставшимся во флаконе кусочкам и продолжайте инкубацию с перемешиванием в течение следующих 30 мин.
г)Центрифугируйте собранные на этапе 14(6) клетки приблизительно 5 мин при 500 g.
д)Ресуспендируйте конечный осадок в 10 мл среды с сывороткой и храните суспензию на льду.
15.Повторяйте этап 11 до тех пор, пока не будет достигнута полная дезагрегация ткани или пока дезагрегация не прекратится (обычно через 3-4 ч).
16.Соберите и объедините охлажденную клеточную суспензию, посчитайте клетки с помощью гемоцитометра или электронного счетчика клеток и проверьте жизнеспособность клеток.
17.Так как клеточная популяция может быть очень гетерогенной, калибровка электронного счетчика клеток может быть затруднена и потребуется подтверждение путем подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
18.Удалите все оставшиеся большие агрегаты с помощью фильтрования через стерильную марлю или специальное сито.
19.Разбавьте суспензию клеток до плотности 1х106/мл ростовой средой и посейте их в такое количество флаконов, какое потребуется, с плотностью приблизительно 2х105кл./см2. Если процент выживания клеток неизвестен или непредсказуем, подсчет клеток даст низкие значения (например, при биопсии опухолей, когда может быть очень высока доля некротических клеток). В этом случае установите диапазон концентраций от 5 до 25 мг ткани на мл.
20.Меняйте среду через регулярные интервалы времени (2-4 дня, руководствуясь признаками понижения pH). Проверьте, нет ли в супернатанте живых клеток, так как некоторые клетки могут медленно прикрепляться или даже могут пролиферировать в суспензии.
| 
