Спектрофотометрический метод определения общего билирубина
и его фракций (метод Эбер-Лейна).
Принцип.
Измерение характерного для билирубина максимума абсорбции при 450 нм после фракционирования билирубина в фосфатном буфере, этилацетате и бутиловом спирте.
Реактивы.
1. Однозамещенный фосфат натрия (NaH2PO4), 0,2 моль/л.
2. Натр едкий, 5 моль/л.
3. Фосфатный буфер рН 5,0; 0,2 моль/л раствор NaH2PO4 доводят до необходимого рН раствором едкого натра 5 моль/л.
4. Этилацетат.
5. п-Бутиловый спирт.
6. Билирубин-эталон лиофилизированный.
Материал для исследования.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
Ход определения. В 2 центрифужные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. В первую приливают 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл этилацетата, во вторую — 2,2 мл фосфатного буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывают, энергично встряхивают и центрифугируют 5— 10 мин, после чего все три образовавшихся слоя переносят осторожно в кюветы спектрофотометра для измерения. Этилацетатный экстракт содержит свободный билирубин, бутаноловый экстракт — свободный билирубин и моноглюкуронид, буферный водный слой — диглюкуронид. Каждую пробу измеряют при 450 и 575 нм (измерение при 575 нм проводят для исключения поглощения за счет гемоглобина).
Из значения экстинкции при 450 нм вычитают значение экстинкции при 575 нм. Дальнейший расчет производят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой можно использовать «Билирубин-эталон лиофилизированный» (), из которого готовят рабочие калибровочные растворы разной концентрации согласно инструкции. Из каждого раствора берут по 0,2 мл и добавляют соответствующий растворитель (этилацетат, п-бутанол, фосфатный буфер). Калибровочные пробы обрабатывают и измеряют при тех же условиях, что опытные пробы.
Оценка результатов.
Непрямореагирующий билирубин и моноглюкуронид билирубина определяют в бутаноловом экстракте; в этилацетатном экстракте определяют непрямореагирующий билирубин; в фосфорно-буферном слое — диглюкуронид билирубина; моноглюкуронид билирубина определяют по разнице содержания билирубина в бутаноловом и этилацетатном экстрактах.
Нормальные величины те же, что в унифицированном методе.
Литература. Eberlein W. R. Pediatrics, 1960, vol. 25, p. 878.
Клиническое значение.
Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл). Предложены различные классификации патологических желтух, при которых в зависимости от механизма их возникновения повышаются различные фракции билирубина.
Заболевания, вызывающие повышение связанного прямореагирующего билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия, синдром Дубина—Джонсона.
Заболевания, вызывающие повышение несвязанного непрямореагирующего билирубина: гемолитическая анемия, пернициозная анемия; несвязанный билирубин бывает также повышен при желтухе новорожденных, болезни Жильбера, синдроме Криглера—Найяра, синдроме Ротора.
При механической желтухе связанный с глюкуроновой кислотой билирубин увеличивается в основном за счет билирубиндиглюкуронида, при паренхиматозной желтухе — билирубин- моноглюкуронида. Прямореагирующий билирубин при гемолитической желтухе новорожденных состоит глав
| 
