НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Принцип.
Использование реакций основных компонентов нуклеиновых кислот: углеводов фосфорной кислоты и оснований.
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ДНК)
Метод Фельгена.
ДНК определяется главным образом реакций на углеводы. Дезоксирибоза, входящая в состав ДНК при гидролизе превращается в альдегид дающий красно-фиолетовое окрашивание с реактивом Шифа.
Посуда и оборудование.
1. Химические стаканы или кюветы емкостью 50 ил.
2. Мерные цилиндры.
3. Градуированные пипетки.
4. Воронки.
5. Колбы емкостью 250 мл.
6. Водяная баня.
Реактивы.
1.Реактив Шиффа.
2. 1 н. раствор соляной кислоты.
3. Сернистая вода.
4. 0,1% спиртовой раствор светло-зеленой краски.
5. Жидкость Карнуа (6 частей C2H5OH, З части хлороформа и 1 частьCH3COOH).
Ход окраски.
1.Препарат фиксируют в жидкости Карнуа в течение 6—10 мин.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде в течение 2 мин.
3. Ополаскивают в растворе холодной 1н. HCI, затем подвергают гидролизу в соляной кислоте при 60С
в течение 4-15 мин, чаще 8-12 мин.
4. Промывают дистиллированной водой.
5. Окрашивают реактивом Шиффа в течение часа.
6. Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
7. Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
8. докрашивают светло-зеленым красителем (лихтгрюн).
9. Промывают в дистиллированной воде.
ДНК окрашивается в фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Клиническое значение.
ДНК является составной частью ядра клетки. В клетках крови по мере их созревания содержание ДНК повышается. В недифференцированных клетках СЦК равен 1,76±0,02, в зрелых гранулоцитах выше 2. У больных гипо и апластической анемией обнаружено уменьшение ДНК в гранулоцитах и лимфоцитах. Снижение содержания ДНК наблюдается при остром лейкозе, обострении хронического миелолейкоза. СЦК ДНК недифференцированных клеток при обострении хронического миелолейкоза составляет 1,46±0,02, не зрелых гранулоцитов 1,53±0,02. Значительное уменьшение количества ДНК в клетках крови наблюдается при лучевой болезни. Цитохимическое исследование ДНК может быть использовано для доказательства ядерного происхождения различных включений клеток.
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Методы окраски и гистохимические реакции в цитологии
Выявление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) по методу Фёльгена.
Метод основан на том, что при кислотном гидролизе в ДНК освобождаются реакционно-способные альдегидные группы, которые затем реагируют с реактивом Шиффа.
Приготовление растворов:
1. Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота) по В. В. Яглову и Л. Н. Моралеву. 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды (комнатной температуры), тщательно взбалтывая в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 10 мл 1 н. хлористоводородной кислоты и 1 г метабисульфита калия или натрия. Раствор в хорошо закрытой колбе помещают в темное место на 24 ч. После обесцвечивания фуксина реактив приобретает желтоватый или коричневый цвет в зависимости от качества основного фуксина. Для окончательной очистки фуксина от примесей добавляют к нему 3-5 растолченных таблеток карболена, хорошо взбалтывают и отфильтровывают в склянку с притертой пробкой. Если полного обесцвечивания реактива не наступает, количество карболена можно увеличить. Реактив лучше хранить в холодильнике. С целью проверки качества полученного реактива Шиффа наливают в бюкс 5 мл реактива и добавляют в него 1 каплю неразведенного кислого формалина. Если реактив отличного качества, то он на глазах приобретает цвет основного фуксина.
2. Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 10% раствора гидросульфита натрия (Na2SO3) и 10 мл 1 н. раствора хлористоводородной кислоты. Сернистая вода готовится перед употреблением и должна обладать характерным запахом диоксида серы (сернистого ангидрида (SO2). Реакцию Фёльгена можно проводить после любого фиксатора, за исключением жидкости Буэна.
Методика проведения реакции:
1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят для гидролиза в 1 н. хлористоводородную кислоту. Гидролиз производят в термостате при температуре 60° С в течение 8—15 мин (кислоту следует заранее согреть);
2) проводят обработку реактивом Шиффа при комнатной температуре в течение 40-80 мин. Склянка с реактивом должна быть защищена от света черной бумагой;
3) из реактива Шиффа срезы переносят в сернистую воду (ни в коем случае не споласкивая!) -3-4 порции сернистой воды по 2 мин в каждой;
4) промывают в водопроводной воде в течение 10 мин;
5) обезвоживают в спиртах, помещают в ксилол, заключают в бальзам
Результат: ядра окрашиваются в красный цвет.
Метод выявления РНК окрашиванием метиловым зеленым - пиронином по Унне-Паппенгейму с контролем рибонуклеазой (реакция Браше).
Использовать метод окраски Унны-Паппенгейма для выявления РНК было предложено Браше. При этом из пары соседних срезов один обрабатывают рибонуклеазой для разрушения РНК. Затем оба среза окрашивают метиловьим зеленым—пиронином и сравнивают. Материал, окрашивающийся в красный цвет пиронином и исчезающий на срезах, обработанных рибонуклеазой, представляет собой РНК. ДНК ядра красится метиловым зеленым в зеленый цвет. Во многих случаях, например при работе с нервной тканью, обработки рибонуклеазой не требуется, так как в ней нет других, кроме РНК, компонентов, окрашивающихся пиронином.
Наилучшим фиксатором для последующей реакции Браше является жидкость Карнуа. Фиксаторы, содержащие тяжелые металлы, негодны, так как тяжелые металлы образуют с РНК устойчивые к перевариванию рибонуклеазой комплексы.
Приготовление растворов. Метиловый зеленый необходимо очистить от образующегося в нем метилового фиолетового. Для этого порошок метилового зеленого заливают хлороформом (10—15 мл хлороформа на 0,1 г красителя), основательно взбалтывают и оставляют на 2—3 ч. Затем снова взбалтывают и фильтруют. Порошок красителя на фильтре еще несколько раз промывают хлороформом. Высушенный порошок используют для приготовления раствора красителя. Можно обрабатывать метиловый зеленый хлороформом и в растворе. В этом случае раствор взбалтывают с хлороформом в делительной воронке и отделяют отслаивающийся, окрашенный в фиолетовый цвет хлороформ. Процедуру повторяют несколько раз до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться. Для приготовления раствора метилового зеленого пиронина 0,5 г метилового зеленого растворяют в 100 мл 0,1 М раствора ацетатного буфера с рН 4,4. К этому раствору прибавляют 0,2 г пиронина. Можно использовать и другую пропись:
метилового зеленого 0,15 г, пиронина 0,25 г, спирта 96° 2,5 мл, глицерина 20 мл, 0,5% водного раствора карболовой кислоты(фенол) 100 мл.
Методика окрашивания:
1) депарафинированные срезы из дистиллированной воды переносят в метиловый зеленый— пиронин на 1—2 ч и более (до 1 сут);
2) срезы быстро споласкивают водой, быстро обсушивают фильтровальной бумагой;
3) быстро (10-15 с) обезвоживают и дифференцируют в абсолютном спирте или в безводном ацетоне;
4) помещают в ксилол, заключают в бальзам.
Результат: ядра синевато-зеленые, РНК ядрышек и цитоплазмы розового цвета.
Ферментативный контроль. Срез обрабатывают в растворе рибонуклеазы в концентрации 0,1-0,5 мг/мл в термостате при 37° С в течение 4—8 ч. Участки клетки, содержащие РНК, после такой обработки пиронином не окрашиваются. Реакция на РНК по Браше не подходит для количественного анализа. Значительно надежнее выявление нуклеиновых кислот с помощью галлоцианина и хромовых квасцов по Эйнарсону.
Выявление нуклеиновых кислот с использованием галлоцианина и хромовых квасцов по Эйнарсону.
При больших значениях рН гаплоцианином и хромовыми квасцами окрашиваются все базофильные структуры. Специфически нуклеиновые кислоты окрашиваются при рН 0,8—1,75. Метод выявляет одновременно ДНК и РНК. Если необходимо выявить только ДНК или только РНК, срез предварительно обрабатывают рибонуклеазой (как указано выше) или дезоксирибонуклеазой. Последнюю растворяют в фосфатном буфере рН 6,5—7,0 в концентрации 0,2 мг/мл и в качестве активатора добавляют хлорид магния в концентрации 0,2 М. Обработку производят при температуре 37° С в течение 4—б ч.
К фиксации особых требований нет, но не следует употреблять фиксаторы, содержащие ртуть или бихромат.
Приготовление раствора: 5г хромовых квасцов (К2SО4Сr2 [SО4]3*24 Н20) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,15 г галлоцианина; раствор кипятят в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и фильтрат доводят дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный раствор имеет рH 1,64 и, следовательно, вполне подходит для выявления нуклеиновых кислот. Раствор пригоден в течение длительного времени.
Методика проведения реакции:
1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят в раствор галлоцианина и хромовых квасцов и окрашивают в течение 48 ч при комнатной температуре;
2) промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой; 3) обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Результат реакции: нуклеиновые кислоты окрашиваются в серовато-синий цвет.
Выявление alfa-аминокислот нингридиновой реакцией по Ясума и Ичикава
используется как общая реакция на белки.
Пригоден материал, фиксированный любым способом. Необходимые растворы: 0,5% раствор нингидрина в абсолютном спирте или 1% раствор аллоксана.
Методика проведения реакции:
1)депарафинированные срезы переносят из дистиллированной воды в раствор нингидрина или аллоксана и выдерживают 16—24 ч при температуре 37° С;
2) промывают водопроводной водой в течение нескольких минут;
3) проводят обработку реактивом Шиффа в течение 15—30 мин;
4) промывают в водопроводной воде 10 мин; 5) обезвоживают в спиртах, заключают в ксилол, бальзам.
Результат: белки окрашиваются в цвета от розового до красно-фиолетового.
| 
