Методы приготовления препаратов хромосом

Баранов В.С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития. 2007

МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ХРОМОСОМ

1. Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов периферической крови

Наиболее простым и доступным, и поэтому распространенным в клинической цитогенетике является анализ хромосом из лимфоцитов периферической крови. Циркулирующие в кровяном русле клетки в норме не пролиферируют, однако в культуральных условиях митогены (фитогемагглютинин (ФГА), покивид, конканавалин А и др.) стимулируют митотическое деление лимфоцитов. При микрометоде используют цельную капиллярную (из пальца или пятки) кровь, при полу-микрометоде и макрометоде — венозную кровь или ее лейкоцитарную фракцию. В любом случае, при взятии крови необходимо строгое соблюдение стерильных условий.

Реактивы

Гепарин (25 000 ед.);

культуральная среда (RPMI 1640 или Игла);

антибиотики (пенициллин — 100 ед/мл + канамицин — 100 мкг/мл,или гентамицин — 50 мкг/мл);

L-глутамин (конечная концентрация 0,2 мг/мл);

сыворотка (эмбрионов коров);

фитогемагглютинин, колхицин (колцемид).

Протокол 1.1

1. В стерильный шприц, содержащий 100–500 ед. гепарина, взять из периферической вены 1–3 мл крови, перемешать.

2. В пенициллиновые флаконы добавить: 4,25–4,5 мл среды с антибиотиками и глутамином; 0,75–0,5 мл сыворотки; 0,3–0,5 мл гепаринизированной крови; ФГА в концентрациях, рекомендуемых фирмой-производителем. Стандартное время культивирования — 72 часа при + 37 °С в закрытой системе. Культуру ежедневно перемешивать, осторожно встряхивая флаконы.

3. На 71-м часу культивирования, т. е. за 50–60 мин до начала фиксации, в культуру ввести колхицин (колцемид) в конечной концентрации 0,15–8,0 мкг/мл.

4. Содержимое флаконов перенести в центрифужные пробирки, клетки осадить центрифугированием при 1000 об/мин 10 мин, супернатант удалить пипеткой, оставляя 0,3–0,5 мл над осадком. Осадок разбить энергичным встряхиванием и добавить 8–10 мл гипотонического раствора (0,55%-й раствор KCl или смесь 1%-го трехзамещенного цитрата Na и 0,55 % KCl, 1:1), перемешать пипетированием и инкубировать 15–20 мин при 37 °С.

5. Фиксация.

Вариант 1. Центрифугировать (10 мин, 1000 об/мин). Осадок тщательно разбить встряхиванием в 0,5 мл надосадочной жидкости.

К осадку струйно прилить 8–10 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1) и перемешать пипетированием. Первую фиксацию проводить при + 4 °С в течение 30 мин. Затем фиксатор сменить 3–5 раз, добавляя порции по 5–7 мл.

Вариант 2. С префиксацией: по окончании времени гипотонической обработки в каждую пробу добавить по 0,5–1,0 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1), перемешать пипетированием и осадить центрифугированием (10 мин, 1000 об/мин). Супернатант удалить, осадок разбить встряхивани ем и провести фиксацию как описано выше в варианте 1.

Вариант 3. К осадку каплями добавить 1 мл фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 9:1), энергично встряхивая пробирку. Затем струйно прилить еще 9 мл фиксатора. Через 2–3 мин клетки осадить центрифугированием, к осадку прилить 10 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирку вручную осторожно встряхивать в течение 10 мин, затем клетки осадить центрифугированием. К осадку прилить 8–10 мл фиксатора 3:1. Через 2–3 мин фиксатор заменить на свежую порцию и продолжить фиксацию в течение 50–60 мин.

6. Приготовление препаратов.

Раскапывание суспензии проводить на предметные стекла, охлажденные в морозильной камере или в холодной воде, нанося на препарат с высоты 30–50 см по 30–50 мкл суспензии. Стекла высушить при комнатной температуре. При плохом разбросе хромосом на препарате рекомендуется высушивать стекла над пламенем спиртовки или поджиганием фиксатора.

2. Рутинная окраска хромосом

Сплошное, или равномерное, окрашивание хромосом получило название рутинной окраски. Этот метод позволяет провести подсчет хромосом на метафазной пластинке и их групповую идентификацию и не пригоден для целей кариотипирования. Ограниченные возможности метода сузили область его применения в современной цитогенетике до анализа и учета некоторых типов хромосомных аберраций в исследованиях мутагенной активности факторов среды.

Протокол 2.1

1. Препараты окрасить 3–5%-м раствором красителя Гимза на стандартном фосфатном буфере при ЯЫкомнатной температуре в течение 5–15 мин в бюксе с красителем или нанесением на препарат 2–5 мл окрашивающего раствора.

2. Промыть проточной водой и высушить.

ПРОПИСИ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Cтандартный фосфатный буфер Соренсена (рН 6,8)

Раствор 1. 1/15 M Na2HPO4 (23,8 г Na2HPO4 × 12Н2О, или 11,8 г

Na2HPO4 × 2Н2О, дистиллированная вода до 1000 мл).

Раствор 2. 1/15 M KH2PO4 (9,1 г, дистиллированная вода до 1000 мл).

Смешать перед употреблением в соотношении 1:1.

2. Буферный раствор GKN, pH 7,8 (10-кратный)

• глюкоза (D + ) — 550 мM (98,0 г)

• KCl — 540 мM (4,0 г)

• NaCl — 13,7 M (80,0 г)

• Na2CO3 — 40 мM (4,2 г)

Дистиллированная вода до 1000 мл

Маточный раствор GKN расфасовать по 15–20 мл и хранить при –20 °С.

Перед употреблением развести в 10 раз.

Для получения рН 9,0 использовать 0,1 N NaOH.

Для получения рН 7,0 использовать 0,1 N HCl.

3. Буферный раствор SKN, pH 7,8

• сахароза — 6,6 мМ (2,26 г)

• KCl — 54 мМ (0,4 г)

• NaCl — 1,37 M (8,0 г)

• Na2CO3 — 4 мM (0,42 г)

Дистиллированная вода до 1000 мл

Для получения рН 9,0 использовать 0,1 N NaOH.

Для получения рН 7,0 использовать 0,1 N HCl.

4. Буферные растворы SSC

4.1. 20×SSC:

• 3 М NaCl (174 г)

• 0,03 M цитрат Na (88,2 г безводной соли)

Растворить в 800 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0 с помощью 1 N HCl, добавить воды до 1000 мл.

4.2. 2×SSC

• 0,3 М NaCl

• 0,003 M цитрат Na

Рекомендуется приготовление из 20×SSC: к 100 мл раствора добавить 900 мл воды.

4.3. 4×SSC

• 0,6 М NaCl

• 0,006 M цитрат Na

Рекомендуется приготовление из 20×SSC: к 200 мл раствора добавить 800 мл воды.

5. Раствор версена

• NaCl — 0,137 M (8,0 г)

• KCl — 2,68 мM (0,20 г)

• Na2HPO4 — 8,06 мM (2,89 г Na2HPO4 . 12 Н2О)

• KH2PO4 — 1,47 мM (0,20 г)

• Na2ЭДТА — 1 мM (0,372 г)

Дистиллированная вода до 1000 г

6. Na-фосфатный буфер (0,01 М)

Раствор 1. 0,1 М Na2HPO4 (35,8 г Na2HPO4 × 12 Н2О, вода до 1000 мл)

Раствор 2. 0,1 М NaH2PO4 (15,6 г NaH2PO4 × 2 Н2О, вода до 1000 мл)

Растворы хранить отдельно. Перед употреблением смешать по 5 мл и довести объем до 100 мл дистиллированной водой.

7. Насыщенный солевой буферный раствор Дюльбекко, рН 7,2:

Раствор 1.

• NaCl — 0,137 M (8,0 г)

• KCl — 2,68 мM (0,20 г)

• Na2HPO4 — 8,06 мM (2,89 г Na2HPO4 × 12 Н2О)

• KH2PO4 — 1,47 мM (0,20 г)

Дистиллированная вода до 1000 г

Раствор 2. СаCl2 — 0,006 М (1,0 г СаCl2 × 2 Н2О в 1 л воды)

Раствор 3. MgCl2 — 0,005 M (1,0 г MgCl2 × 6 Н2О в 1 л воды)

Растворы хранить отдельно. Перед употреблением к 160 мл раствора 1 добавить по 20 мл растворов 2 и 3.

8. Цитратно-фосфатный буфер Мак-Ильвейна

Раствор 1. 0,2 М Na2HPO4 (71,6 г Na2HPO4 × 12 Н2О, вода до 1000 мл)

Раствор 2. 0,1 M лимонная кислота (19,2 г, вода до 1000 мл)

Для получения 200 мл смешать растворы в следующих пропорциях:

рН 4,0 — 77,1 мл раствора 1 и 122,9 мл раствора 2

рН 4,2 — 82,8 мл раствора 1 и 117,2 мл раствора 2

рН 5,0 — 103,0 мл раствора 1 и 97,0 мл раствора 2

рН 5,4 — 111,5 мл раствора 1 и 88,6 мл раствора 2

рН 7,0 — 164,7 мл раствора 1 и 35,3 мл раствора 2