Принцип метода:
продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом, состоящим из серной, фосфорной кислот и ванилина, соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
Реактивы:
1) концентрированная серная кислота по Савалю;
2) концентрированная ортофосфорная кислота;
3) 0,6 % водный раствор ванилина.(0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании смеси на водяной бане. После охлаждения объем до-
водят до 100 мл. Раствор стабилен, если хранить его при комнатной температуре);
4) фосфорнованилиновая смесь. (4 части концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с одной частью 0,6 % раствора ванилина. Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре);
5) хлороформ х.ч. или «для наркоза»;
6) основной (12,0 г/л) стандартный раствор триолеина. 1200 мг триолеина растворяют в 100 мл хлороформа. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Ход работы:
опытная проба . К 0,05 мл сыворотки крови прибавляют 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, далее пробирку вынимают и сразу же охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры. Из пробирки отбирают 0,2 мл смеси, которую переносят в другую пробирку, содержащую 3 мл фосфорнованилиновой смеси. После тщательного перемешивания пробы оставляют на 45 мин в темноте при комнатной температуре. Экстинкцию измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (длина волны 500–600 нм) в кювете 0,5 см. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.
Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,05 мл воды.
Данные к построению калибровочного графика
для определения общих липидов в сыворотке крови
№
пробирок
| Основной
стандартный
раствор
триолеина, мл
| Хлороформ, мл
| Концентрация
общих
липидов, г/л
| 1
| 0,17
| 0,83
| 2,0
| 2
| 0,33
| 0,67
| 4,0
| 3
| 0,50
| 0,50
| 6,0
| 4
| 0,67
| 0,33
| 8,0
| 5
| 0,83
| 0,17
| 10,0
| 6
| 1,00
| -
| 12,0
|
Обратите внимание!
1. Сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 6 дней (не замораживая ее).
2. При концентрации общих липидов выше 12 г/л сыворотку следует развести дистиллированной водой. При расчете учесть разведение.
3. Посуду, применяемую для определения общих липидов, необходимо прополоскать спиртом.
Расчет производят по калибровочному графику или по формуле (норма 4,0–8,0 г/л).
Расчет по калибровочному графику.
Из каждого разведения, указанного в таблице, берут по 0,05 мл рабочего стандартного раствора и далее пробы обрабатывают так же, как опытные. Пользуясь полученными данными, строят калибровочный график. Прямая зависимость между содержанием общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 12 г/л.
Расчет по формуле.
Общие липиды (г/л) = Еоп/Ест. – Сст., где Е – экстинкция опытных и стандартных проб; С – концентрация основного стандартного раствора (12,0 г/л).
|
